周金蕙,王 寧,母強元,劉 朱，王大慶

0引言

基底細胞癌(basal cell carcinoma, BCC)是人類最常見的惡性腫瘤之一[1]，也是眼瞼部位最常見的惡性上皮源性腫瘤，約占眼瞼惡性腫瘤的90%，多見于60～80歲老年人，好發(fā)于下瞼(50%)[2-6]。眼瞼BCC易出現(xiàn)倒睫、瞼內翻等并發(fā)癥，因而屬于高危型BCC。大量研究證實，紫外線、放射線及遺傳因素等均是導致眼瞼BCC發(fā)生的危險因素[7-8]。原癌基因異常激活或抑癌基因失活，多種相關蛋白、細胞因子等發(fā)生改變，均可導致細胞過度增殖、分化, 凋亡受阻, 最終引發(fā)腫瘤[9]，但其確切發(fā)病機制尚不清楚。

正常情況下，細胞外基質是抗腫瘤形成的屏障。但當細胞發(fā)生癌變時，其周圍鄰近的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)也會發(fā)生相應的變化以支持癌癥的發(fā)展[10-11]，從而被稱之為腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)[12]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與其微環(huán)境改變的相關性在眾多研究中得到了驗證[12-14]，其中癌相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)是存在于腫瘤微環(huán)境中最豐富的細胞類型之一，其主要功能是提供并維持良好的腫瘤細胞生長和增殖的微環(huán)境，從而在腫瘤的增殖、侵襲、轉移及血管生成過程中起關鍵作用[10,13-15]。

成纖維活化蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)是CAFs 最具代表性的分泌產物之一，在90%以上的上皮細胞癌CAFs和部分腫瘤細胞中高水平表達，而在人類正常組織中幾乎不表達，已有研究表明FAP的高表達與大部分腫瘤的侵襲轉移具有一定的相關性[12,16]。眼瞼BCC發(fā)病率高，具有侵襲性生長的特點，但其惡性程度和轉移性較低[17]，其微環(huán)境中CAFs表達FAP的情況以及FAP在其侵襲性生長中的作用尚不明確。因此，為了回答上述問題，本研究經原代細胞培養(yǎng)獲得眼瞼基底細胞癌CAFs及正常成纖維細胞(normal fibroblasts，NFs)，然后檢測FAP在兩種細胞中的表達情況，以期進一步探討FAP在人眼瞼基底細胞癌CAFs中的作用，探索影響眼瞼BCC發(fā)生、發(fā)展的關鍵因素，為BCC的預防、早期診斷及治療提供理論依據及新思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標本來源選取川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科2016-10/2017-05期間收治的擬行眼瞼基底細胞癌切除術和老年性眼瞼皮膚松弛癥矯正術共6例6眼患者的組織標本作為研究對象。其中3例3眼眼瞼BCC患者(圖1A)為CAFs標本來源；3例3眼老年性眼瞼皮膚松弛癥患者(圖1B)為NFs標本來源，組織標本均經術后病理證實。6例患者均無創(chuàng)傷及其他部位腫瘤等疾患，年齡為47～80歲，男女比例為1∶2，符合標本來源均衡性(P<0.05)。本研究經本院倫理委員會審批通過，組織標本的收取均獲得患者的知情同意并簽署知情同意書。

圖1 標本來源 A：CAFs標本來源；B：NFs標本來源。

1.1.2主要實驗材料主要試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基(H-DMEM)、0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)， 胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)，RNA提取試劑(TRIzol)(北京Leagene生物有限公司),逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(Thermo)，兔抗人波形蛋白(vimentin，VIM)單克隆抗體、鼠抗人細胞角蛋白(cytokeratin，CK)(廣譜)單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體、兔抗人成纖維細胞活化蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)多克隆抗體(英國Abcam公司)，鼠抗人β-actin抗體、山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物(杭州華安生物科技公司)。主要儀器設備：生物安全柜(BSC-1000 II A2，蘇凈安泰公司，中國)、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(CCL-170B-8，ESCO，印尼)、倒置相差顯微鏡(DM1L，Leica，德國)、實時定量PCR儀(11491，Roche，瑞士)、酶標儀(iMark，BIO-RAD，日本)、電泳儀(PowerPacTMHC，BIO-RAD，新加坡)、電轉儀(Trans-Blot SD Cell，BIO-RAD，美國)、Fusion曝光儀(Vilber Fusion solo4，Vilber，法國)。

1.2方法

1.2.1標本的收集和處理從川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科手術室在無菌條件下完整切取新鮮基底細胞癌組織和正常眼瞼皮膚組織，盡可能不破壞組織完整性，將其放置于預先加入少許合成培養(yǎng)基的無菌1.5mL離心管中，用含冰袋的保溫箱低溫迅速轉移至實驗室超凈工作臺。所有標本取材均由同一位有經驗的術者操作。

1.2.2CAFs及NFs細胞原代培養(yǎng)及細胞處理用含0.1%雙抗的PBS溶液反復清洗標本3次，置于細胞培養(yǎng)皿中剪去除多余上皮和脂肪組織，將剩余的組織分成大小約1mm3的小塊后播種于含4mL合成培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，平放在含5% CO2的37℃ 恒溫細胞孵育箱中培養(yǎng)原代細胞。早期每天用倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)情況，每2～3d換液。當細胞生長鋪滿瓶底時，采用胰酶差速消化法進行細胞傳代和純化，使用第3～6代純化細胞進行實驗研究。

1.2.3觀察細胞并鑒定細胞倒置相差顯微鏡下，觀察第3代純化的眼瞼CAFs和NFs細胞形態(tài)，拍攝圖片。細胞免疫化學染色(SP法)鑒定兩種細胞，步驟如下：爬片：將5.0×103個CAFs和NFs接種于酸預處理置于6孔板中的無菌載玻片上；固定：載玻片浸入4%多聚甲醛中室溫固定30min；破膜：0.5% Triton X-100溶液處理15min；滅活：3% H2O2滅活內源性過氧化物酶室溫處理30min；封閉：正常山羊血清封閉液室溫孵育30min；一抗孵育：滴加用PBS液稀釋的一抗(稀釋比例均為1∶100)，濕盒，4℃過夜孵育；二抗孵育：滴加山羊抗兔/小鼠 IgG/HRP 聚合物(稀釋比例均為1∶100)，37℃避光孵育30min；顯色：滴加DAB顯色液(按DAB試劑盒說明臨時配制使用，原液與稀釋液比例為1∶50)，3～5min，自來水洗滌終止；復染：蘇木素染核；脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并拍照記錄結果。

1.2.4細胞生長增殖活力測定將眼瞼CAFs和NFs分別接種于96孔板中(4.0×103個/孔)，每例細胞設置6個復孔，置于37℃含5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24h，取出一塊96 孔板，向每孔加入20μL 0.5% MTT溶液，作用4h后吸除含MTT溶液的上清液，加入150μL DMSO后置于酶聯(lián)免疫檢測儀上，避光震蕩10min使紫色結晶物充分溶解，選擇490nm波長，檢測其吸光光度值(OD值)；按以上步驟連續(xù)進行7d，記錄數據，并進行統(tǒng)計學分析，繪制生長曲線。

1.2.5實時定量聚合酶反應用TRIzol處理細胞提取總RNA后逆轉錄合成cDNA。RT-qPCR循環(huán)條件為：初始變性(95℃下10min)、40次變性(95℃下15s)、退火(60℃下60s)、延伸(60℃下60s)。引物序列如下：FAP mRNA引物序列：上游引物：5’-TAG AAC CAT GCT TTG GAG ATA CT- 3’；下游引物：5’-CAA CAG GCG ACC AGC ATA AA- 3’。β-actin引物序列：上游引物：5’-ACA GAG CCT CGC CTT TGC C- 3’；下游引物：5’-GAT ATC ATC ATC CAT GGT GAG CTG G- 3’。以β-actin作為內參對照標準進行定量分析。使用公式2-△△Ct獲得實驗組樣本基因的相對表達量。

1.2.6蛋白免疫印跡分析用RIPA裂解緩沖液提取蛋白，使用BCA蛋白分析試劑盒測定總蛋白含量。用10% SDS-PAGE分離等量蛋白質，然后將蛋白帶轉移到膜上。在4℃條件下，與一抗抗體(稀釋比例：FAP 1∶3000，β-actin 1∶1000)輕輕搖勻共同孵育一夜。添加二抗抗體(稀釋比例：羊抗兔二抗 1∶10000，羊抗鼠二抗 1∶2000)，在室溫下孵育1h。采用Fusion FX5程序曝光顯影對其免疫反應進行檢測和分析，引入β-actin作為內參對照。應用Image J軟件對所獲得的條帶灰度值進行統(tǒng)計分析。

2結果

2.1眼瞼CAFs和NFs的細胞培養(yǎng)和分離及純化結果在原代培養(yǎng)第3d可見上皮細胞和CAFs從癌組織塊邊緣爬出，癌上皮細胞呈團狀生長，CAFs排列緊密，呈放射狀生長，約7d鋪滿瓶底；NFs組細胞生長相對緩慢，原代培養(yǎng)第5～7d組織塊邊緣可見少量的上皮細胞和NFs,NFs形態(tài)規(guī)則，排列稀疏，約11～13d鋪滿瓶底。待細胞鋪滿瓶底經胰酶差速消化法傳代與純化后，CAFs和NFs在形態(tài)上均未發(fā)生明顯改變，上皮細胞消失，原代CAFs生長速度明顯快于NFs。

2.2眼瞼CAFs及NFs的初步鑒定結果

2.2.1細胞形態(tài)學觀察結果倒置顯微鏡下可見，眼瞼CAFs體積較大，呈長梭形或紡錘形，胞質突明顯減少，而胞漿內具有較多顆粒，細胞大小差異明顯，生長較快，排列紊亂且密集，喪失接觸抑制和密度抑制，存在明顯的重疊生長現(xiàn)象(圖2A)；NFs呈扁平長梭形，胞漿內顆粒較少，細胞大小相對均一，分散排列，存在接觸抑制和密度抑制現(xiàn)象(圖2B)。

圖2 細胞培養(yǎng) A：CAFs從組織塊邊緣呈放射狀爬出，細胞較緊密，出現(xiàn)重疊現(xiàn)象；B：NFs從組織塊邊緣散在爬出，細胞較松散，未見緊密接觸。

2.2.2免疫細胞化學檢測結果FAP、VIM、α-SMA、CK在細胞中陽性表達主要表現(xiàn)為胞質中出現(xiàn)淡棕色或棕黃色顆粒。免疫化學染色結果示：CAFs組： FAP、VIM、α-SMA呈陽性，CK呈陰性(圖3A～D)；NFs組：除了陽性表達VIM外，其余均為陰性表達(圖3E～H)。

圖3 免疫細胞化學染色 CAFs：A：CK呈陰性表達, B：VIM呈陽性表達，C：α-SMA呈陽性表達，D： FAP呈陽性表達；NFs：E：CK呈陰性表達，F(xiàn)：VIM呈陽性表達，G：α-SMA呈陰性表達，H:FAP呈陰性表達。

2.3細胞生長增殖活力檢測結果兩組間OD值比較差異有統(tǒng)計學意義(F組間=1882，P組間<0.0001；F時間=1464，P時間<0.0001；F組間×時間=323.5，P組間×時間<0.0001)，見表1。繪制細胞生長曲線，并在細胞對數生長期以y分別為0.27、0.54劃線,其與細胞生長曲線交叉點x的差值分別表示CAFs和NFs的群體倍增時間，即Tc=4.39-1.01=3.38d、Tn=5.06-1.01=4.05d。通過繪制細胞生長曲線及倍增時間比較可見CAFs增殖速度相對更快，且呈持續(xù)增長狀態(tài)，但其在第4d后增速逐漸減緩；而NFs于第5d細胞數達峰值后開始逐漸減少，見圖4。在第2～7d的增殖活力測定中，CAFs及NFs兩者之間同一天內的增殖能力比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 細胞生長增殖活力MTT法檢測結果

圖4 CAFs與NFs生長曲線比較圖。

2.4RT-qPCR法檢測兩種細胞中FAPmRNA含量統(tǒng)計分析結果顯示眼瞼CAFs中FAP mRNA擴增含量(3.672±0.221)明顯高于眼瞼NFs含量(1.034±0.024)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=21.58,P=0.002)，見圖5。

圖5 FAP mRNA相對表達水平比較。

2.5WesternBlot檢測FAP蛋白表達結果Western Blot法檢測兩種細胞中FAP蛋白的表達結果示CAFs表達較高水平的FAP，而NFs幾乎不表達FAP(圖6A)。統(tǒng)計分析結果示，F(xiàn)AP在CAFs中的表達量明顯高于NFs，兩者之間的差異具有統(tǒng)計學意義(t=11.720,P=0.007)，見圖6B。

圖6 FAP蛋白表達水平 A：具有代表性的FAP蛋白水平的Western Blot圖像;B：用三個獨立實驗的總結數據對免疫印跡進行定量分析。

3討論

腫瘤或癌的發(fā)生、發(fā)展是多種因素共同作用的結果，許多證據表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤微環(huán)境變化緊密相關[18-19]。大量研究表明，CAFs是腫瘤微環(huán)境中最重要、最豐富的間質細胞之一,其存在有利于合成更多的細胞外基質蛋白質，為腫瘤的生長、侵襲等提供更有利的物質條件，故而也被認為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移和侵襲的關鍵調節(jié)因素之一[20]。FAP是Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，屬于二肽基肽酶家族一員，具有二肽基肽酶和內肽酶雙重蛋白水解酶活性，其內肽酶活性可降解腫瘤組織細胞外基質，參與細胞外基質的重塑，在多種人類惡性上皮腫瘤CAFs中高表達，也在部分腫瘤細胞中表達[8]，通過不斷釋放促腫瘤生長和促血管生成介質，介導上皮間質轉化并抑制免疫應答，參與腫瘤的生長、侵襲、轉移，并與部分患者的不良預后密切相關[11-12, 16]。眼瞼BCC以局部侵襲性生長為特征，但惡性程度和轉移性均較低，所以本次我們探討了其微環(huán)境中CAFs表達FAP的情況以及FAP在其侵襲性生長中的作用。

本實驗采用組織塊貼壁法，成功獲得了純化的原代眼瞼CAFs與NFs，并對CAFs的生物學特性進行了初步鑒定，發(fā)現(xiàn)CAFs呈紡錘形或長梭形，胞質突減少，增殖速率更快，存活能力更強，排列緊密，可重疊生長，喪失了接觸抑制現(xiàn)象，分泌更多骨膜蛋白、生長因子等，與NFs存在明顯的不同，這些差異與國內外文獻報道相似[21-22]。除了形態(tài)學特征改變之外，還需要使用細胞的特異性蛋白進行免疫細胞化學染色來鑒定兩種細胞。因為CAFs是腫瘤間質中活化的成纖維細胞，具備平滑肌細胞和成纖維細胞雙重特征，所以它們既表達肌纖維母細胞特異標記α-SMA、FAP等[19,23-25]，又表達成纖維細胞標志物VIM[26]，但上皮細胞標志物CK為陰性表達[27-28]。因此，我們選用既往研究中常見的α-SMA、FAP、VIM及CK作為CAFs檢測指標，運用免疫細胞化學方法對眼瞼CAFs及NFs進行了鑒定。實驗結果顯示：眼瞼CAFs表達α-SMA、FAP及VIM均陽性，CK為陰性；NFs除表達VIM陽性外，其余均陰性。其中α-SMA和FAP已被證實在體外培養(yǎng)的NFs中無表達或極低表達，免疫細胞化學染色技術不能發(fā)現(xiàn)，但RT-qPCR方法可能檢出[29]，本實驗的結果與國內外研究結果一致[30]。

我們通過MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)，CAFs較NFs具有更強的生長增殖及存活能力(P<0.05)，其群體倍增時間明顯較NFs縮短，表明腫瘤組織中CAFs呈激活狀態(tài)，與NFs正常表型存在明顯差異，本實驗的結果與我們前期的研究結果一致[22]。然后，我們進一步通過RT-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)，眼瞼基底細胞癌CAFs中FAP mRNA擴增水平明顯高于NFs(P<0.05)；且Western Blot實驗發(fā)現(xiàn)眼瞼CAFs高表達FAP，而NFs不表達FAP(P<0.05)，與國內外許多相關研究結果一致[11,23,31-33]，提示眼瞼基底細胞癌腫瘤微環(huán)境發(fā)生了變化，進一步誘導NFs生物學特性和功能發(fā)生變化，最終轉變?yōu)镃AFs。以上分析結果表明，眼瞼基底細胞癌CAFs中FAP表達增強可能與其生長增殖特性改變以及浸潤性生長有關。

目前關于FAP與CAFs相關的研究結果大多來源于一些惡性程度高、轉移性強且范圍廣的腫瘤類型，如乳腺癌[32]、胃癌[34]、結直腸癌[35]等。不同來源的腫瘤和不同區(qū)域腫瘤的CAFs的表型組成不同，因此其形態(tài)、功能具有異質性[33]。多數研究認為FAP促進腫瘤生長、轉移、侵襲，但也有研究發(fā)現(xiàn)FAP-a除了發(fā)揮其酶的活性外，還具有非酶功能，認為其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能具有抑制作用[33]。有研究發(fā)現(xiàn)FAP可能參與FAK、PTEN/PI3K/Akt和Ras-ERK信號通路調控細胞增殖、遷移、侵襲及轉移[32-33]。

本實驗通過對比研究發(fā)現(xiàn)眼瞼BCC與正常眼瞼皮膚組織中相關成纖維細胞生物學特性以及FAP的表達存在明顯差異，這說明腫瘤微環(huán)境中成纖維細胞已經發(fā)生生物學特性和分泌功能的變化，并參與基底細胞癌的發(fā)生發(fā)展。FAP作為CAFs特異性的標記蛋白，其在眼瞼基底細胞癌表達明顯增高，推測其可能與CAFs的生長增殖特性改變以及眼瞼基底細胞癌的浸潤性生長有密切聯(lián)系，可能是眼瞼基底細胞癌病因及防治的新靶標，但其具體作用機制有待進一步深入研究。