朱慧萍 劉振東 朱影

肝癌是全球第三大癌癥，其發(fā)病率持續(xù)上升。盡管肝硬化是肝癌發(fā)生的基礎(chǔ)，但許多分子通路參與了肝癌的發(fā)生，包括端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子突變、Wnt/β-catenin、p53、Akt/mTOR、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體/RAS/MAPK通路[1]。中醫(yī)認(rèn)為，中晚期肝癌普遍存在熱毒內(nèi)蘊(yùn)、氣滯血瘀的臨床特點(diǎn)，臨床上采用清熱解毒為主、健脾行氣活血為輔的中肝合劑治療中晚期肝癌配合西藥對(duì)癥治療可提高中晚期原發(fā)性肝癌患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)其生存時(shí)間[2]。氣陰兩虛是惡性腫瘤患者的重要病理特點(diǎn)，益氣養(yǎng)陰法為中醫(yī)扶正培本的大法，也是治療癌癥的常法[3]。有研究指出，早期肝癌患者以肝郁脾虛型為主，中晚期患者以氣陰兩虛型為主。晚期患者肝癌日久，癌毒、血瘀、濕熱等病邪侵犯人體，耗傷正氣，氣虛則血虛，日久耗損陰血，最終表現(xiàn)為氣陰兩虛[4]。生脈飲方藥由一補(bǔ)一潤(rùn)一斂之藥（人參、麥冬、五味子）組成，根據(jù)臨床實(shí)踐，本次研究將人參替換為太子參。太子參有補(bǔ)氣健脾之功，使中焦健運(yùn)，陰津生化有源。麥冬、五味子養(yǎng)陰生津[3]。因此，本次研究將探究加味中肝合劑（中肝合劑聯(lián)合生脈飲）聯(lián)合化療藥物對(duì)裸鼠肝癌移植瘤的影響，并闡明相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 中藥制劑的準(zhǔn)備 中肝合劑組方：白毛藤15 g、白茅根15 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g、三葉青9 g、重樓9 g、金錢草15 g、焦山梔9 g、三棱9 g、莪術(shù)12 g、溫郁金12 g、白芍12 g、陳皮12 g、青皮12 g、焦山楂9 g、炙雞內(nèi)金5 g。加味中肝合劑組方在中肝合劑組方的基礎(chǔ)上增加：白毛藤15 g、太子參15 g、麥冬12 g、五味子6 g。兩方分別加水煎煮兩次，頭煎40 min，二煎30 min，濾取兩次煎出液，合并、沉淀、吸取上清液濃縮至200 ml，分裝、封口、濕熱蒸汽滅菌，貼標(biāo)簽備用。

1.2 動(dòng)物造模與分組 取BALB/c 雄性裸小鼠，5 周齡，體重約16 g左右。取5×106/0.2 ml細(xì)胞濃度的Bel-7404 人肝癌細(xì)胞，用無(wú)菌注射器接種于裸鼠右前腋窩皮下。待皮下腫瘤最長(zhǎng)徑長(zhǎng)至≥1.5 cm后，用乙醚吸入法麻醉并處死裸鼠，完整切除腫瘤，放入含100 U/ml青霉素、鏈霉素的0.9%氯化鈉注射液中，反復(fù)漂洗2～3 次，每次5 min，剔除周圍結(jié)締組織，取腫瘤邊緣生長(zhǎng)旺盛的組織切成直徑1.5 cm×1.5 cm 的腫塊，用套管針把組織送至另一只裸鼠的腹股溝，依此法傳代一次。待腫瘤組織第三代最短直徑長(zhǎng)至≥1.5 cm 時(shí)，以此作為肝癌組織皮下移植材料，取腫瘤邊緣生長(zhǎng)旺盛的組織無(wú)菌條件下切成約1.5 cm×1.5 cm大小，用套管針把瘤組織送至裸鼠右前腋窩皮下，術(shù)后不使用抗生素，共計(jì)50只裸鼠。移植2 周后，50只裸鼠隨機(jī)分為五組：模型組、中肝合劑組、加味中肝合劑組、化療組、加味中肝合劑與化療聯(lián)合治療組，每組各10只。模型組不加任何藥物干預(yù)，予0.9%氯化鈉注射液灌胃對(duì)照；中肝合劑組以濃縮的中肝合劑0.4 ml灌胃，每天1 次；加味中肝合劑組以濃縮的加味中肝合劑0.4 ml 灌胃，每天1 次；化療組以5-氟尿嘧啶劑量30 mg/kg 經(jīng)鼠尾靜脈注射，每2 天1 次；聯(lián)合治療組結(jié)合中藥灌胃與5-氟尿嘧啶靜脈注射。五組用藥時(shí)間均為2 周。

1.3 方法

1.3.1 抑瘤率測(cè)定 給藥結(jié)束24 h 后處死全部荷瘤小鼠，切開(kāi)腫瘤周圍皮膚，完整剝離腫瘤，去除脂肪組織并稱重。將瘤組織用消毒錫箔紙包裹后迅速置于超低溫冰箱凍存。比較各組小鼠腫瘤的平均重量，并按公式計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率=（陰性對(duì)照組平均瘤體重量-實(shí)驗(yàn)組平均瘤體重量）/ 陰性對(duì)照組平均瘤體重量×100%。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)p27 基因表達(dá) 取瘤體組織剪碎，加入Trizol 研磨，高速離心后轉(zhuǎn)上層水相于另一EP管中，加氯仿?lián)u勻振蕩再離心取上清后加異丙醇，搖勻、離心棄上清，加入75%乙醇，振蕩器混勻再離心后沉淀用DEPC水溶解，沖吸混勻完全備用。逆轉(zhuǎn)錄RT；設(shè)計(jì)并合成引物，建立PCR反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增；完成溶解曲線試驗(yàn)及定量數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 Western blot檢測(cè)KLF8蛋白表達(dá) 將配制好的蛋白裂解液1 ml加入勻漿管中，加入稱量好的組織塊，在冰盒中勻漿，將勻漿液以15 000 r/min離心后取上清，測(cè)定提取物中蛋白含量。調(diào)整樣品蛋白濃度為400 μg/ml。將樣品及蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別加入等體積的蛋白電泳上樣緩沖液，煮沸5 min，使蛋白質(zhì)變性。SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)移膜置于5%脫脂奶粉搖動(dòng)1.5 h封閉。洗膜后二抗孵育，二氨基聯(lián)苯胺顯色，將顯色完畢的膜用凝膠成像儀顯像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法（最小顯著性法）。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同給藥組治療后對(duì)裸鼠肝癌組織瘤重和抑瘤率的影響見(jiàn)圖1和表1

表1 不同給藥組治療后對(duì)肝癌組織瘤重和抑瘤率的影響

圖1 不同給藥組治療后對(duì)裸鼠肝癌組織瘤重和抑瘤率的影響

由圖1 可見(jiàn)，不同給藥組瘤體大小直徑比較：模型組＞中肝合劑組＞加味中肝合劑組＞化療組＞聯(lián)合治療組，瘤體質(zhì)量減輕明顯。

由表1 可見(jiàn)，模型組、中肝合劑組、加味中肝合劑組、化療組、聯(lián)合治療組瘤體重量逐漸減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.42，P＜0.05），抑瘤率逐漸增強(qiáng)。

2.2 不同給藥組治療后肝癌組織中p27mRNA表達(dá)見(jiàn)表2

表2 不同給藥組治療后肝癌組織中p27mRNA表達(dá)

由表2可見(jiàn)，五組肝癌組織中的p27mRNA的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.73，P＜0.05）。與模型組比較，中肝合劑組p27mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異（t=-1.78，P＞0.05），而加味中肝合劑組、化療組、聯(lián)合治療組的肝癌組織中的p27mRNA 表達(dá)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=-4.37、-7.41、-7.59，P均＜0.05）。

2.3 不同給藥組治療后肝癌組織中KLF8蛋白表達(dá)見(jiàn)圖1和表3

表3 不同給藥組治療后肝癌組織中KLF8蛋白表達(dá)

圖1 不同給藥組治療后肝癌組織KLF8蛋白表達(dá)

由圖1 可見(jiàn)，與模型組比較，中肝合劑組、加味中肝合劑組、化療組、聯(lián)合治療組的肝癌組織中的KLF8蛋白表達(dá)均有所降低。

由表3可見(jiàn)，五組肝癌組織中的KLF8 蛋白表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=41.12，P＜0.05）。與模型組比較，中肝合劑組KLF8 蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（t=1.14，P＞0.05），而加味中肝合劑組、化療組、聯(lián)合治療組的肝癌組織中的KLF8蛋白表達(dá)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=5.96、7.51、11.63，P均＜0.05）。

3 討論

何福根等[5]研究明確指出中肝合劑能預(yù)防化療藥物對(duì)肝臟的損害。肝癌射頻術(shù)后患者常存在氣陰兩虛的證候特點(diǎn)，治療以益氣養(yǎng)陰為主，可改善肝癌患者的相關(guān)癥狀，提高其生存質(zhì)量[6]。有研究指出，生脈飲加味聯(lián)合化療治療氣陰兩虛型老年晚期非小細(xì)胞肺癌不僅可以改善患者的免疫水平，還可以降低不良反應(yīng)發(fā)生率[7]。生脈飲聯(lián)合百合固金湯治療老年中晚期氣陰兩虛證肺癌化療患者有增效減毒作用[8]。生脈飲注射液輔助治療放療后氣陰兩虛證直腸癌可明顯減輕臨床癥狀，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[9]。本次研究結(jié)果顯示，模型組、中肝合劑組、加味中肝合劑組、化療組、聯(lián)合治療組瘤體重量逐漸減輕（P＜0.05），抑瘤率逐漸提高。說(shuō)明加味中肝合劑聯(lián)合化療組較于單純化療組或者加味中肝合劑組抑制肝癌細(xì)胞增殖的效果更強(qiáng)，中肝合劑聯(lián)合生脈飲具有增強(qiáng)化療藥物對(duì)荷瘤裸鼠肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

本次研究結(jié)果顯示，與模型組比較，中肝合劑組、加味中肝合劑組、化療組、聯(lián)合治療組的肝癌組織中的p27mRNA表達(dá)均明顯升高（P均＜0.05）。說(shuō)明加味中肝合劑聯(lián)合化療組治療后較于單純化療組或者加味中肝合劑組，上調(diào)p27mRNA表達(dá)的作用更強(qiáng)，進(jìn)而較強(qiáng)地抑制荷瘤裸鼠肝癌細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮其更強(qiáng)的抗腫瘤作用。p27 通過(guò)影響細(xì)胞周期依賴性復(fù)合物CDK6/CCND1 的形成來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，但不直接影響CDK6 和CCND1 的表達(dá)。喉鱗狀細(xì)胞癌中CyclinE 基因的激活使p27 基因表達(dá)下調(diào)，使得處于發(fā)育過(guò)程的細(xì)胞過(guò)多地進(jìn)入細(xì)胞周期，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生乃至浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后較差[10]。E6AP 通過(guò)以E2F1依賴的方式抑制p27 的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)p27 的表達(dá)。同時(shí)下調(diào)E6AP 和p27 可部分恢復(fù)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]。

KLF8在胃癌中的表達(dá)顯著高于正常胃組織，其高表達(dá)可能與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，對(duì)胃癌診斷及預(yù)后評(píng)估具有重要參考價(jià)值[12]。KLF8 通過(guò)直接結(jié)合到E-cadherin 啟動(dòng)子的TG 盒，抑制基因啟動(dòng)子，從而誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展[13]。干擾KLF8 后能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞中STAT3 的磷酸化水平，KLF8 可能通過(guò)作用于STAT3 信號(hào)通路影響骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[14]。KLF8在肝癌中通過(guò)PI3K/AKT 信號(hào)通路誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A 的表達(dá)，KLF8 表達(dá)上調(diào)的肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)新生血管生成的潛能[15]。本次研究結(jié)果顯示，與模型組比較，不同給藥組治療后肝癌組織中的KLF8 蛋白表達(dá)均明顯降低（P均＜0.05）。說(shuō)明加味中肝合劑聯(lián)合化療組治療后較于單純化療組或者加味中肝合劑組，下調(diào)KLF8 蛋白表達(dá)的作用更強(qiáng)，進(jìn)而可能較強(qiáng)地抑制荷瘤裸鼠肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及肝癌組織內(nèi)新生血管的生成，從而增強(qiáng)其抗癌作用。KLF8 在肝癌中起轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用，主要直接調(diào)控凋亡相關(guān)基因。KLF8 基因敲除促進(jìn)了細(xì)胞凋亡過(guò)程，并導(dǎo)致相關(guān)的H3K27ac 增加，從而抑制高遷移率族蛋白或基質(zhì)金屬蛋白酶的生物學(xué)效應(yīng)[16]。KLF8在肺癌中的上調(diào)促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖和集落形成。KLF8 與JMJD2A 啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)P21 和CDK4 的表達(dá)，從而參與KLF8 對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控[17]。

綜上所述，加味中肝合劑聯(lián)合5-氟尿嘧啶能夠顯著抑制裸鼠肝癌的生長(zhǎng)增殖，效果優(yōu)于化療組、加味中肝合劑組以及中肝合劑組，且肝癌組織中的抑癌基因p27mRNA 明顯升高，而促癌因子KLF8 蛋白表達(dá)明顯降低，推測(cè)其作用機(jī)制可能與抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)。