莫濡冰，黃琳惠，蒙 沖，蔡興俊

CD4T淋巴細(xì)胞(CD4T)在哮喘發(fā)病中起重要作用。許多研究表明，Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強(qiáng)是哮喘臨床癥狀的主要原因，尤其是嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。然而，最近幾項(xiàng)研究表明，中性粒細(xì)胞(而非嗜酸性粒細(xì)胞)是持續(xù)或急性加重哮喘患者的主要炎性細(xì)胞類型。此外，越來越多的研究表明哮喘是一種高度異質(zhì)性疾?。恍枰芯恐行粤＜?xì)胞在哮喘中的作用，以確定治療哮喘期間中性粒細(xì)胞氣道炎癥的其他選擇。CB2受體是G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，主要在免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中表達(dá)，并且其表達(dá)水平在T細(xì)胞活化過程中增加。此外，CB2受體是T細(xì)胞亞群形成所必需的。由于CB2與免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)，因此，其被認(rèn)為是炎癥性疾病的可能治療靶點(diǎn)。目前，CB2激動劑可作為治療炎性疾病的潛在藥理學(xué)工具，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、結(jié)腸炎等。有研究表明，CB2的保護(hù)活性取決于滑膜組織，T淋巴細(xì)胞以及腸神經(jīng)元中表達(dá)的CB2受體。然而，關(guān)于CB2受體活化在緩解中性粒細(xì)胞型哮喘中作用的報(bào)告較少。該研究通過構(gòu)建中性粒細(xì)胞大鼠哮喘模型，分析了JTE-907(大麻素類CB2受體反向激動劑)對疾病的治療效果，并通過觀察其對CD4幼稚T細(xì)胞分化影響來確定CB2受體活化的潛在治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1

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1

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1

實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠(無特定病原體等級，4周齡)購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK-(京)2016-0002，雄性。大鼠在SPF條件下[溫度：(25±0.5)℃，濕度：(55±5)%，12 h/12 h明暗循環(huán)]飼養(yǎng)，并提供無菌食物和水。從SD大鼠的脾臟中分離出CD4T細(xì)胞。通過使用DynabeadsMouse Pan B清除B細(xì)胞，隨后用Na?ve CD4T細(xì)胞大鼠分離試劑盒對B缺失的細(xì)胞部分進(jìn)行陰性選擇。加入抗CD3e(5 μg/ml)和抗CD28(1 μg/ml)抗體激活CD4細(xì)胞6 d，然后加入特定的細(xì)胞因子和抗體混合物用于誘導(dǎo)Th細(xì)胞亞型的極化：Th1分化加入白介素(interleukin，IL)-12(10 ng/ml)和Anti-IL-4(5 μg/ml)，Th2分化加入IL-4(10 ng/ml)和Anti-IL-12(5 μg/ml)，Th9分化加入IL-4(10 ng/ml)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β(10 ng/ml)和Anti-IL-12(5 μg/ml)，Th17分化加入IL-6(10 ng/ml)、TGF-β(10 ng/ml)、Anti-IL-4(5 μg/ml)和Anti-IL-12(5 μg/ml)，Treg分化加入TGF-β(10 ng/ml)、Anti-IL-4(5 μg/ml)和Anti-IL-12(5 μg/ml)。同時(shí)，加入或不加入JTE907[溶解在二甲亞砜(DMSO)中至終濃度10mol/L，并在細(xì)胞培養(yǎng)基中稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度10、10或10mol/L]與細(xì)胞一起培養(yǎng)6 d，獲得分化的T細(xì)胞亞型。

1

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1

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2

試劑與儀器 DynabeadsMouse Pan B購自美國Invitrogen公司，Na?ve CD4T細(xì)胞大鼠分離試劑盒購自美國Miltenyi公司，JTE907購自英國R&D Systems公司，RNeasy Plus Micro Kit、高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Qiagen公司，TaqMan基因表達(dá)預(yù)混液購自美國Applied Biosystem公司，RNA引物購自美國Thermo fisher公司，OVA(雞卵清蛋白)、LPS購自美國Sigma-Aldrich公司，氣道炎癥評估ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司，大鼠OVA特異性IgE ELISA試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司，RIPA裂解緩沖液購自北京Solarbio公司。7300 qRT-PCR系統(tǒng)購自美國Applied Biosystem公司，F(xiàn)ACS CantoTM II流式細(xì)胞儀購自美國BD Biosciences公司，F(xiàn)lowJo 7.6.1軟件購自美國Tree Star公司。

1.2 實(shí)時(shí)定量PCR

使用RNeasy Plus Micro Kit進(jìn)行RNA分離。使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA轉(zhuǎn)換為cDNA。所有qRT-PCR反應(yīng)均使用7300 qRT-PCR系統(tǒng)進(jìn)行，擴(kuò)增使用TaqMan基因表達(dá)預(yù)混液進(jìn)行。使用以下引物檢測RNA表達(dá)：Tbx21、Gata3、IL-9、ROR-C、FoxP3、CNR2和管家基因18S rRNA。使用2方法進(jìn)行qRT-PCR分析。

1.3 模型建立和實(shí)驗(yàn)分組

將40只動物隨機(jī)分為4組(

n

=10)：對照組、模型(Model)組、JTE-907低劑量組(JTE-907-L，腹腔注射5 mg/kg)和JTE-907高劑量組(JTE-907-H，20 mg/kg)。除正常對照組外，其他組的大鼠在實(shí)驗(yàn)方案的第0和7天分別通過2次腹膜內(nèi)注射10 mg OVA(雞卵清蛋白)和鼻腔滴入0.1 μg LPS。從第15天起，將大鼠放入密閉室35×25×15(cm)中，連續(xù)3周(30 min/次和1次/2 d)暴露于2% OVA的氣溶膠中。在用OVA霧化刺激前2 h，JTE-907組每天1次通過腹腔注射給藥對大鼠進(jìn)行不同濃度的JTE-907治療。其余組腹腔注射生理鹽水。

1.4 標(biāo)本采集

在最后一次OVA激發(fā)后24 h內(nèi)，每只大鼠腹腔注射10%水合氯醛，劑量為4 mg/kg。用玻璃毛細(xì)管從眼后叢取血樣并離心，血清在液氮中快速冷凍，并在-80 ℃下儲存。將大鼠胸腔切開，切斷氣管上部并插管。常規(guī)收集的支氣管肺泡灌洗液(BALF)，并在400 r/min下離心10 min，并將上清液保存在-80 ℃下備用。將BALF沉淀物重懸于PBS中以進(jìn)行細(xì)胞涂片，獲得白細(xì)胞計(jì)數(shù)。收集BALF后，從右肺切下肺組織用于組織學(xué)分析。其余的肺組織樣品用于蛋白質(zhì)提取。

1.5 血清OVA特異性IgE測定

使用大鼠OVA特異性IgE ELISA試劑盒進(jìn)行OVA特異性IgE測量。

1.6 氣道炎癥評估

使用血細(xì)胞儀測定細(xì)胞總數(shù)。BALF細(xì)胞涂片用Gimsa染色，以確定細(xì)胞計(jì)數(shù)差異。通過ELISA試劑盒分析BALF中干擾素(interferon，IFN)-γ、IL-5、IL-17、IL-10和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors，TNF)-α的水平。

1.7 組織學(xué)分析

大鼠肺組織在4%多聚甲醛中固定3 d，石蠟包埋。切片(5 μm)用常規(guī)組織學(xué)技術(shù)進(jìn)行HE染色，在觀察病理和結(jié)構(gòu)變化。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)

計(jì)算大鼠脾臟的T細(xì)胞懸液，制備成細(xì)胞10個(gè)/ml，用FITC-anti-CD4、APC-anti-CD25抗體染色30 min，然后固定和滲透，再用PE-抗Foxp3，PE-抗IL-17A抗體染色1 h。在FACS CantoTM Ⅱ流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，并用FlowJo 7.6.1軟件處理結(jié)果。

1.9 Western blot分析

采用RIPA裂解緩沖液從肺組織中提取蛋白質(zhì)。將含有20 μg蛋白質(zhì)的樣品在10%的SDS-PAGE凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉膜2 h，然后用相應(yīng)的主要抗體：RORγt(1∶4 000稀釋)、Foxp3(1∶2 000稀釋)、STAT5(1∶2 000稀釋)、p-STAT5(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶5 000稀釋)在4 ℃下培養(yǎng)過夜。最后用HRP結(jié)合的二級抗體(1∶5 000稀釋)孵育2 h，用ECL試劑顯影。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析各組間Th特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)、OVA-sIgE水平、BALF細(xì)胞、肺組織的炎癥評分、BALF中細(xì)胞因子水平和肺組織中Th17和Treg轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Tukey檢驗(yàn)各組間的顯著性。

P

<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CB2受體參與CD4

T細(xì)胞分化

qRT-PCR分析顯示，JTE907不能誘導(dǎo)Tbx21(圖1A)、IL-9(圖1B)、GATA3(圖1C)和ROR-C(圖1D)的轉(zhuǎn)錄。相反，JTE907在所有測試濃度下誘導(dǎo)FoxP3的轉(zhuǎn)錄(圖1E)。在此背景下，該研究還通過qRT-PCR分析了CB2受體的表達(dá)，結(jié)果顯示JTE907處理在所有測試濃度下上調(diào)了CNR2表達(dá)(圖1F)。

圖1 qRT-PCR檢測JTE907調(diào)節(jié)Th特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

2.2 JTE-907對血清OVA特異性IgE水平及BALF細(xì)胞變化的影響

OVA致敏和LPS刺激后，模型組大鼠血清中OVA-sIgE水平上調(diào)。相反，JTE-907治療組降低了大鼠血清中OVA-sIgE水平(圖2A)。對照組BALF細(xì)胞總數(shù)為14.27×10個(gè)，僅有少量嗜酸性粒細(xì)胞和少量中性粒細(xì)胞(2.39×10)。模型組BALF中肺細(xì)胞總數(shù)(36.2×10)、中性粒細(xì)胞(9.26×10)和嗜酸性粒細(xì)胞(6.57×10)增多。經(jīng)JTE-907處理的小鼠的總細(xì)胞數(shù)減少(23.68×10)，并且JTE-907還減少了中性粒細(xì)胞(5.3×10)、嗜酸性粒細(xì)胞(3.09×10)和巨噬細(xì)胞(9.49×10)的絕對數(shù)量(圖2B)。

圖2 JTE-907的體內(nèi)治療對中性粒細(xì)胞哮喘的發(fā)展的影響

2.3 JTE-907對氣道炎癥的抑制作用

為了獲得炎癥細(xì)胞浸潤到組織中的證據(jù)，在最后一次OVA刺激后通過HE染色對大鼠肺切片進(jìn)行分析。與對照組相比，模型組的大鼠支氣管周圍和血管周圍結(jié)締組織的炎性細(xì)胞數(shù)量增加，表明炎癥細(xì)胞滲入肺組織(

t

=6.712，

P

<0.001)。相反，在以5和20 mg/kg 的濃度給藥時(shí)，JTE-907處理降低了炎癥細(xì)胞的浸潤(

t

=4.829、5.547，

P

=0.006)(圖3)。為探討JTE-907對細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，用ELISA法檢測了BALF中細(xì)胞因子水平。與正常對照組的大鼠相比，模型組大鼠BALF中的炎性細(xì)胞水平要高得多。與模型組相比，JTE-907治療組大鼠BALF中IFN-γ、TNF-α、IL-17和IL-5水平降低(

P

<0.05)，并且IL-10水平升高(

P

<0.05)(圖4)。

圖3 JTE-907抑制了肺組織中炎癥細(xì)胞的募集

圖4 ELISA試劑盒檢測JTE907對BALF中細(xì)胞因子水平影響

2.4 JTE907對中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠脾臟的Th17/Treg平衡的影響

為了解JTE-907是如何通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠的T細(xì)胞反應(yīng)來發(fā)揮治療效果，該研究探討了JTE-907治療對大鼠脾臟中Th17和Treg細(xì)胞失衡的影響。與正常對照組相比，模型組大鼠脾臟中Th17/Treg比例要高得多(

t

=4.915，

P

=0.005)。與模型組相比，JTE-907治療組大鼠脾臟中Th17/Treg比例降低(

t

=3.071、2.659，

P

=0.028、0.035)(圖5)。這些結(jié)果表明，JTE-907治療可以通過恢復(fù)Th17/Treg細(xì)胞的平衡來減輕大鼠的哮喘。

圖5 JTE907對中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠脾臟的Th17/Treg平衡的影響

2.5 JTE907調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠肺組織中Th17和Treg轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子RORγt和Foxp3分別在Th17和Treg細(xì)胞的分化和功能中起關(guān)鍵作用。為了確定JTE907對RORγt和Foxp3表達(dá)的影響，該研究評估了大鼠肺組織中RORγt和Foxp3的蛋白水平。如圖6所示，與正常對照組相比，模型組大鼠中RORγt蛋白水平增加(

P

<0.05)和Foxp3蛋白水平降低(

P

<0.05)。JTE-907處理抑制了RORγt蛋白水平(

P

<0.05)，并增加了Foxp3蛋白水平(

P

<0.05)。這些結(jié)果表明JTE-907處理可恢復(fù)中性粒細(xì)胞哮喘模型大鼠肺組織中Th17/Treg細(xì)胞的平衡。STAT5激活對于Treg細(xì)胞的分化和維持以及抑制Th17細(xì)胞的分化至關(guān)重要。因此，研究分析了大鼠肺組織中STAT5和p-STAT5的蛋白水平。結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織中STAT5的磷酸化水平降低(

P

<0.05)，而JTE-907處理增加了STAT5的磷酸化水平(

P

<0.05)(圖6)。結(jié)果表明JTE907可以增強(qiáng)STAT5的磷酸化，這可能有助于其對Th17/Treg平衡的調(diào)節(jié)作用。

圖6 JTE907對肺組織中Th17和Treg轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響

3 討論

已知在中性粒細(xì)胞性哮喘中，Th17細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在該疾病中起重要作用。Wilson et al研究表明Th17反應(yīng)可促進(jìn)氣道中性粒細(xì)胞增多和急性氣道高反應(yīng)性。低劑量LPS可增強(qiáng)Th17介導(dǎo)的反應(yīng)，導(dǎo)致IL-17等細(xì)胞因子的釋放和中性粒細(xì)胞的浸潤。最近一項(xiàng)研究表明，與對照哮喘患者相比，哮喘患者痰中IL-5和IL-17A mRNA過度表達(dá)，并且Th17極化異常與哮喘患者的激素敏感性和嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此，更好地了解中性粒細(xì)胞哮喘的發(fā)病機(jī)制和Th17極化的發(fā)展將有助于目前類固醇不敏感或嚴(yán)重哮喘的治療。在目前的研究中，采用OVA致敏和LPS刺激后，大鼠出現(xiàn)典型的Th17免疫反應(yīng)過度激活和IL-5上調(diào)的病理改變，表明中性粒細(xì)胞哮喘動物模型建立成功。

在幾種炎癥模型中，CB2信號傳導(dǎo)抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及白細(xì)胞募集到炎癥部位，從而降低疾病進(jìn)展，例如在EAE、脊髓損傷和應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中。目前，已有研究表明通過CB2受體導(dǎo)致免疫抑制的機(jī)制包括誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖、抑制促炎性細(xì)胞因子和誘導(dǎo)Treg細(xì)胞。由于其在治療炎癥和自身免疫疾病中的潛在應(yīng)用價(jià)值，因此，選擇特異性激活CB2受體化合物治療可能對中性粒細(xì)胞性哮喘有用。JTE907作為CB2的反向激動劑，具有較高的特異性；JTE907在嚙齒動物模型中具有抗炎、抗過敏特性。該研究表明通過腹腔注射JTE907治療對大鼠的哮喘具有保護(hù)作用，表現(xiàn)在BALF中的炎癥細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比降低，并且T細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-5、IL-17)以及中性粒細(xì)胞相關(guān)的炎癥介質(zhì)TNF-α降低，而抗炎細(xì)胞因子IL-10水平升高。因此，該研究推測JTE907通過調(diào)節(jié)CD4幼稚T細(xì)胞向效應(yīng)T細(xì)胞的分化來減弱炎癥細(xì)胞的浸潤。

研究進(jìn)一步探討了CB2受體活化對CD4T細(xì)胞分化影響。在體外實(shí)驗(yàn)中，JTE907能夠誘導(dǎo)CD4幼稚T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化。但是，它不會誘導(dǎo)其他亞型的T細(xì)胞分化，例如Th1、Th2、Th9和Th17細(xì)胞。眾所周知，Treg細(xì)胞功能紊亂在多種炎癥和自身免疫性疾病中起著重要作用；因此，JTE907可能在治療以Treg細(xì)胞失調(diào)為特征的疾病方面具有巨大的潛力。此外，在體內(nèi)試驗(yàn)中模型組大鼠脾臟和肺組織中Th17/Treg比例比正常組高得多。近年來，研究表明Th17/Treg失衡在中性粒細(xì)胞性哮喘的炎癥誘導(dǎo)和維持中具有重要作用。與JTE907對細(xì)胞因子譜的調(diào)節(jié)作用一致，它降低Th17細(xì)胞比例，增加Treg細(xì)胞百分率，從而恢復(fù)了Th17/Treg的平衡。此外，該研究還表明了JTE907可以增強(qiáng)STAT5的磷酸化。據(jù)報(bào)道，STAT5可以直接結(jié)合Foxp3基因誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的發(fā)育和維持，也可以直接結(jié)合RORγt基因抑制Th17相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。因此，JTE907對Th17/Treg平衡的調(diào)節(jié)作用可能與增強(qiáng)STAT5的磷酸化有關(guān)。

綜上所述，CB2受體的激活對Th-17介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞哮喘大鼠有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制包括改善Th17/Treg平衡以及調(diào)節(jié)其各自的細(xì)胞因子水平。此外，STAT5的激活可能是JTE907對Th17/Treg失衡調(diào)節(jié)作用的潛在機(jī)制。