曹艷紅，王保龍

在中國(guó)，肺癌是相當(dāng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)生率和病死率均很高。非小細(xì)胞肺癌大約占肺癌類型的85%，而肺鱗癌又是非小細(xì)胞肺癌的主要病理類型，且與肺腺癌相比，肺鱗癌發(fā)病機(jī)制的研究和治療明顯滯后。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)屬于一組沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼能力的轉(zhuǎn)錄本，全長(zhǎng)200多個(gè)核苷酸,具有保守的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可與蛋白質(zhì)、DNA和RNA相互作用，通過(guò)多種機(jī)制在多種層面調(diào)控基因的表達(dá)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，lncRNA參與人類多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展，與細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞凋亡等途徑密切相關(guān)。通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選，與正常組織相比，lncRNA DGUOK-AS1在腫瘤組織中表達(dá)量異常升高,采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)lncRNA DGUOK-AS1的表達(dá)，研究DGUOK-AS1對(duì)肺鱗癌增殖和凋亡的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

肺鱗癌NCI-H520 和SK-MES-1細(xì)胞株均購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院；胎牛血清(PN血清和BI血清)、DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基以及0.25%細(xì)胞胰酶消化液均購(gòu)自合肥颯英斯生物科技有限公司；TRIzol試劑和Lipofectamine 2000均購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司；DGUOK-AS1引物、siRNA及陰性對(duì)照siRNA-NC均購(gòu)自合肥通用生物公司；熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；Annexin V/PI法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Biolegend公司；PCNA、Bcl2、Bax、cyclin D1、c-myc和β-cantenin抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；RNA質(zhì)核分離試劑盒購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司。

1.2 方法

1

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2

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1

細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5% CO的培養(yǎng)條件下，用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)NCI-H520細(xì)胞，用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)SK-MES-1細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞的融合度約90%時(shí)，則進(jìn)行細(xì)胞傳代及后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2

細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 細(xì)胞傳代時(shí)，將NCI-H520和SK-MES-1細(xì)胞接種于6孔板，第2天待細(xì)胞密度約40%～60%時(shí)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，將DGUOK-AS1-siRNA和siRNA-NC基因序列分別轉(zhuǎn)染于NCI-H520和SK-MES-1兩種肺鱗癌細(xì)胞中。

1

.

2

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3

qRT-PCR檢測(cè)DGUOK-AS1的表達(dá) 利用TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA,使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑和qRT-PCR定量試劑盒檢測(cè)DGUOK-AS1的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算DGUOK-AS1的相對(duì)表達(dá)量。

1

.

2

.

4

CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 將DGUOK-AS1-siRNA和siRNA-NC基因序列分別轉(zhuǎn)染于NCI-H520和SK-MES-1細(xì)胞，48 h后，胰蛋白酶進(jìn)行消化，分別接種于96孔板中，平行設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO溫箱中培養(yǎng)，分別檢測(cè)0、24、48、72 和96 h細(xì)胞的增殖情況。每孔加入10 μl的CCK-8試劑,溫箱溫育2 h后，利用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定雙波長(zhǎng)450、630 nm處的吸光度值。

1

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2

.

5

細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將DGUOK-AS1-siRNA和siRNA-NC基因序列分別轉(zhuǎn)染于NCI-H520和SK-MES-1細(xì)胞，48 h后，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，采用Annexin v FITC/PI雙染，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)干擾組和對(duì)照組的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)并分析細(xì)胞凋亡率的變化。

1

.

2

.

6

Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化 將DGUOK-AS1-siRNA和siRNA-NC基因序列分別轉(zhuǎn)染于NCI-H520和SK-MES-1細(xì)胞，48 h后提取總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再將其轉(zhuǎn)到PVDF膜上，接下來(lái)用10%的脫脂牛奶封閉，再分別加入相對(duì)應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST溶液洗膜3次后，加入配好的二抗，室溫孵育1 h，即可進(jìn)行曝光，檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。

1

.

2

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7

RNA質(zhì)核分離驗(yàn)證DGUOK-AS1的亞細(xì)胞定位 收集NCI-H520和SK-MES-1細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明，提取細(xì)胞總RNA、細(xì)胞質(zhì)RNA以及細(xì)胞核RNA, 接下來(lái)使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑和qRT-PCR定量試劑盒分別檢測(cè)DGUOK-AS1的表達(dá)，以GAPDH作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參，U6作為細(xì)胞核內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，兩組獨(dú)立樣本之間均值的比較，采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)推斷方法為

t

檢驗(yàn)，樣本統(tǒng)計(jì)量

t

值用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，當(dāng)

P

<0.05時(shí)，被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DGUOK-AS1在肺鱗癌組織和細(xì)胞系中均呈高表達(dá)

首先通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示肺鱗癌組織中l(wèi)ncRNA DGUOK-AS1高表達(dá)(

P

<0.05)。見(jiàn)圖1A。隨后在細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證，qRT-PCR結(jié)果顯示，肺鱗癌細(xì)胞系NCI-H520和SK-MES-1中DGUOK-AS1的表達(dá)水平高于正常肺上皮細(xì)胞(BEAS-2B)(NCI-H520:

t

=153.2,

P

<0.001;SK-MES-1:

t

=121.8,

P

<0.001)。見(jiàn)圖1B。因此，選取lncRNA DGUOK-AS1作為后續(xù)的研究對(duì)象。

圖1 LncRNA DGUOK-AS1的差異表達(dá)

2.2 干擾DGUOK-AS1對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖的影響

為了進(jìn)一步探究DGUOK-AS1在肺鱗癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用，首先利用siRNA技術(shù)干擾DGUOK-AS1的表達(dá)，用qRT-PCR分別檢測(cè)NCI-H520和SK-MES-1細(xì)胞干擾組和對(duì)照組中DGUOK-AS1的表達(dá)，與對(duì)照組相比，干擾組DGUOK-AS1的表達(dá)水平下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(NCI-H520：

t

=55.47,

P

<0.001;SK-MES-1:

t

=25.2,

P

<0.001)。見(jiàn)圖2A。隨后，用CCK-8試劑檢測(cè)干擾DGUOK-AS1對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示干擾組的細(xì)胞增殖能力降低(

P

<0.01)。見(jiàn)圖2B、C。隨后，檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原PCNA蛋白表達(dá)的變化,結(jié)果顯示干擾組PCNA表達(dá)下降。見(jiàn)圖2D、E。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，當(dāng)DGUOK-AS1表達(dá)量降低時(shí)，肺鱗癌細(xì)胞的增殖可能受到抑制。

圖2 干擾DGUOK-AS1對(duì)NCI-H520和SK-MES-1細(xì)胞增殖的影響

2.3 干擾DGUOK-AS1對(duì)肺鱗癌細(xì)胞凋亡的影響

首先利用siRNA技術(shù)降低DGUOK-AS1的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DGUOK-AS1干擾組和對(duì)照組細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，降低DGUOK-AS1的表達(dá)可使肺鱗癌細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(NCI-H520:

t

=37.3,

P

<0.001;SK-MES-1:

t

=58.48,

P

<0.01)，見(jiàn)圖3A～D。Western blot結(jié)果顯示，肺鱗癌細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)降低，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高，從而促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞的凋亡，見(jiàn)圖3E、F。以上結(jié)果顯示，干擾 DGUOK-AS1可促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞的凋亡。

圖3 干擾DGUOK-AS1對(duì)NCI-H520和SK-MES-1細(xì)胞凋亡的影響

2.4 干擾DGUOK-AS1對(duì)Wnt/β-Cantenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為了檢測(cè) DGUOK-AS1是否可以通過(guò)Wnt/β-catenin通路影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，利用Western blot檢測(cè)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白：β-catenin、c-myc及cyclin D1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，β-catenin、c-myc及cyclin D1蛋白在DGUOK-AS1干擾組的表達(dá)降低(NCI-H520:

t

=22.25,

P

<0.001;

t

=28.15,

P

<0.001;

t

=38.17,

P

<0.001;SK-MES-1:

t

=34.64,

P

<0.001;

t

=60.47,

P

<0.001;

t

=15.12,

P

<0.01)，見(jiàn)圖4A～D。以上數(shù)據(jù)表明，下調(diào)DGUOK-AS1的表達(dá)可能通過(guò)抑制 Wnt/β-cantenin信號(hào)通路，從而影響肺鱗癌細(xì)胞的增殖及凋亡。

圖4 干擾DGUOK-AS1對(duì)Wnt/β-Cantenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 lncRNA DGUOK-AS1在細(xì)胞中的主要定位

為了深入探究DGUOK-AS1可能的作用機(jī)制，首先對(duì)DGUOK-AS1的亞細(xì)胞定位進(jìn)行驗(yàn)證，利用lncLocator數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DGUOK-AS1的定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果提示DGUOK-AS1可能主要定位于細(xì)胞質(zhì)。見(jiàn)表1。隨后在肺鱗癌NCI-H520和SK-MES-1細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，以GAPDH作為質(zhì)內(nèi)參，U6作為核內(nèi)參，RNA質(zhì)核分離結(jié)果顯示DGUOK-AS1主要位于細(xì)胞質(zhì)(圖5A、B)，這提示DGUOK-AS1可能發(fā)揮CeRNAs的作用來(lái)調(diào)節(jié)下游基因，從而進(jìn)一步影響肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展。

圖5 lncRNA DGUOK-AS1在NCI-H520和SK-MES-1細(xì)胞中的主要定位

表1 lncLocator 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DGUOK-AS1定位預(yù)測(cè)

3 討論

肺鱗癌是比較常見(jiàn)的非小細(xì)胞肺癌的病理類型，在全世界每年約有40多萬(wàn)人死于肺鱗癌，且其發(fā)病常與吸煙密切相關(guān)。由于肺鱗癌缺乏可以作為藥物靶點(diǎn)的致瘤突變，晚期肺鱗癌的標(biāo)準(zhǔn)治療以化療為主，因此，至今鮮有較好的靶向治療手段。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序、基因芯片等技術(shù)的興起，研究表明在多種類型的腫瘤中，lncRNA的異常表達(dá)對(duì)尋找有效的腫瘤治療靶點(diǎn)具有重要的參考意義。lncRNA調(diào)控腫瘤的作用機(jī)制主要有2種：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。前者在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)與核內(nèi)因子作用發(fā)揮調(diào)控作用；后者可以在細(xì)胞質(zhì)中競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源RNAs(CeRNAs)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮非常重要的調(diào)控作用。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，LncRNA RHPN1-AS1可以通過(guò)抑制細(xì)胞遷移和增殖在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用,LncRNA ZEB1-AS1可以通過(guò)在宮頸癌中上調(diào)ZEB1的表達(dá)，參與細(xì)胞侵襲和上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。另外也有研究報(bào)道，LncRNA LINC01089可作為臨床預(yù)后的標(biāo)志，并通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-cantenin信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，lncRNA PCAT6也通過(guò)Wnt/β-cantenin信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)也是宮頸癌的預(yù)后指標(biāo)。

目前與肺鱗癌相關(guān)的lncRNA的研究尚未深入，lncRNA在肺鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的功能及機(jī)制亟待進(jìn)一步探索。對(duì)于LncRNA DGUOK-AS1的研究較少，僅有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道其在宮頸癌中高表達(dá)，影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，但在其他腫瘤中尚未報(bào)道。在該研究中，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示DGUOK-AS1在肺鱗癌組織中高表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)DGUOK-AS1在肺鱗癌細(xì)胞系中也呈現(xiàn)高表達(dá)。DGUOK-AS1的干擾抑制肺鱗癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，這決定了DGUOK-AS1在肺鱗癌中起癌基因的作用。此外，降低DGUOK-AS1的表達(dá)，Western blot 結(jié)果顯示W(wǎng)nt/β-cantenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白：β-cantenin、c-myc及cyclin D1蛋白表達(dá)降低，表明DGUOK-AS1可能通過(guò)激活Wnt/β-cantenin 信號(hào)通路，進(jìn)而影響肺鱗癌細(xì)胞的增殖及凋亡。

文獻(xiàn)中證實(shí)位于細(xì)胞質(zhì)中DGUOK-AS1可與miR-653-5p結(jié)合影響其靶基因EMSY的表達(dá)，從而影響宮頸癌細(xì)胞的增殖。該研究表明肺鱗癌細(xì)胞中DGUOK-AS1也主要定位于細(xì)胞質(zhì)，提示這可能通過(guò)發(fā)揮CeRNAs的作用影響肺鱗癌細(xì)胞的增殖與凋亡。該研究后續(xù)將通過(guò)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)及篩選肺鱗癌細(xì)胞中DGUOK-AS1所靶向的miRNA,并利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步探究DGUOK-AS1影響肺鱗癌發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在分子機(jī)制。

綜上所述，該研究初步表明lncRNA DGUOK-AS1可以促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞增殖，抑制肺鱗癌細(xì)胞的凋亡，可能為肺鱗癌患者治療策略的探索提供新的思路。