朱 瑞，金世云，郭成曉，張 野

體外循環(huán)下行心臟手術(shù)是多種心臟疾病如心瓣膜病、冠心病及先天性心臟病等主要治療手段。然而實(shí)施體外循環(huán)后，心臟常經(jīng)歷全心缺血及再灌注過(guò)程，不可避免會(huì)發(fā)生心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IRI)。嗎啡作為臨床經(jīng)典的阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥，在基礎(chǔ)研究及臨床實(shí)踐中均表明可減輕心肌IRI，雖然目前對(duì)嗎啡心肌保護(hù)作用的研究較為廣泛，但其確切機(jī)制仍未能完全闡明。細(xì)胞凋亡是IRI過(guò)程中主要機(jī)制之一，Caspase-3作為細(xì)胞凋亡中關(guān)鍵調(diào)控因子，其是否參與嗎啡降低心肌細(xì)胞凋亡水平，減輕IRI目前尚不明確。該研究通過(guò)制備大鼠全心缺血再灌注損傷模型，觀(guān)察嗎啡預(yù)處理(morphine preconditioning, MP)對(duì)全心缺血再灌注后心肌中Caspase-3表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，以進(jìn)一步明確MP心肌保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

鹽酸嗎啡注射液(1 ml：10 mg，批號(hào)：190104-2，東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司)；氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)(批號(hào)：129K1867V，美國(guó)Sigma公司)；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗Caspase-3單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)；鼠抗β-actin單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；Langendorff離體心臟灌注系統(tǒng)(安徽淮北正華有限責(zé)任公司)；Power Lab數(shù)據(jù)采集裝置(澳大利亞AD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及全心缺血再灌注損傷模型制備

健康雄性成年SD大鼠，體質(zhì)量為220～260 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(皖)2017-001。參照參考文獻(xiàn)制備全心離體缺血再灌注損傷模型，SD大鼠斷頭處死，剔除非心臟組織，迅速取出心臟置于4 ℃ K-H液(mmol/L：118.5 NaCl、4.7 KCl、1.2 MgSO、25.0 NaHCO、1.2 KHPO、11.0葡萄糖、2.5 CaCl)中，立刻懸掛于Langendorff灌注裝置上，采用9.8 kPa恒壓逆行灌注K-H液。使用95% O和5% CO混合氣預(yù)充K-H液，并維持pH值7.35～7.45，溫度37 ℃。于心臟左心耳剪個(gè)小口，將一自制乳膠水囊由該小口經(jīng)二尖瓣置入左心室，連接Power Lab壓力傳感器，調(diào)節(jié)水囊大小及位置，保持左室舒張末壓在0～1.33 kPa之間。操作完成，待心臟穩(wěn)定15 min后，心臟有心律失?；蜃笫野l(fā)展壓<9.31 kPa的棄之不用。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

51只SD大鼠使用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(

n

=17)：對(duì)照組(Sham組)、全心缺血再灌注組(IR組)、MP組(1 μmol/L，MP組)。于大鼠心臟穩(wěn)定15 min后通過(guò)夾閉灌注導(dǎo)管全心缺血30 min，再恢復(fù)灌注10、60、120 min，制備全心缺血再灌注損傷模型。Sham組心臟持續(xù)灌K-H液至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(195 min)。IR組于心臟灌注45 min K-H液后進(jìn)行全心缺血再灌注。MP組于心臟穩(wěn)定15 min后，灌注含1 μmol/L鹽酸嗎啡的K-H液和無(wú)嗎啡的K-H液各5 min，進(jìn)行3個(gè)周期后制備全心缺血再灌注損傷模型。

1.4 心肌梗死體積百分比測(cè)定

再灌注120 min后取下大鼠心臟(

n

=8)，將心臟置于-80 ℃冰箱充分冷凍后，沿心臟縱軸線(xiàn)切成2 mm的薄片5～6片，置于1% TTC溶液(pH 7.4)中，37 ℃水浴鍋中孵育10 min，然后于10%福爾馬林液固定過(guò)夜，白色為的梗死區(qū)(infarct size，IS)，磚紅色為缺血危險(xiǎn)區(qū)(area at risk, AAR)。采用Imaging J 1.51圖像分析軟件計(jì)算IS及AAR，并計(jì)算IS/AAR比值。

1.5 LDH活性測(cè)定

所有組離體心臟于穩(wěn)定灌注15 min(基礎(chǔ)值)、再灌注后10、60、120 min時(shí)收集冠狀動(dòng)脈流出液3～5 ml，采用化學(xué)比色法測(cè)定LDH活性。

1.6 Western blot測(cè)定Caspase-3蛋白表達(dá)

于再灌注10、60及120 min時(shí)取下大鼠心臟(

n

=9即每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只，同一大鼠心臟分別進(jìn)行Western blot試驗(yàn)和TUNEL染色)。取組織標(biāo)本剪碎，加入RIPA裂解液，冰上靜止60 min，4 ℃ 高速離心機(jī)13 000 r/min離心15 min后取上清液，行BCA蛋白定量。按1∶4加入×5上樣緩沖液于蛋白質(zhì)樣本中，水浴100 ℃變性10 min，使用蛋白預(yù)制膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。110 V電泳60 min，然后200 mA電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST溶液)室溫孵育PVDF膜2 h，TBST溶液漂洗10 min×3次后，加入1∶1 000的Caspase-3兔一抗及β-actin小鼠一抗，4 ℃孵育過(guò)夜后TBST液漂洗10 min×3次，加入1∶10 000二抗室溫孵育1 h，TBST液漂洗10 min×3次，采用ECL發(fā)光試劑盒，使用Tanon全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)掃描PVDF膜，采集圖像。使用Image J 1.51圖像分析軟件分析Caspase-3與β-actin的蛋白灰度值，并以Sham組為參照計(jì)算各組蛋白相對(duì)比值。

1.7 TUNEL染色

于再灌注10、60、120 min時(shí)取下大鼠心臟(

n

=9)，將心肌組織蠟塊固定切片(5 μm)，經(jīng)脫蠟、水化后加入蛋白酶K工作液37 ℃處理20 min，漂洗3次后過(guò)氧化物酶封閉30 min，加入50 μl Tunel反應(yīng)液于37 ℃暗濕盒反應(yīng)1 h，漂洗3次加入POD轉(zhuǎn)換液于37 ℃暗濕盒反應(yīng)30 min，漂洗3次進(jìn)行DAB顯色，蘇木精復(fù)染，碳酸鋰藍(lán)化，脫水透明，中性樹(shù)膠封片，掃描儀掃描后進(jìn)行觀(guān)察心肌細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 TTC染色顯示

各組AAR體積差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Sham組比較，IR組再灌注后IS/AAR比值顯著升高(

P

<0.05)，與IR組比較，MP組可顯著降低缺血再灌注后IS/AAR比值(

F

=136.44，

P

<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠心肌梗死面積TTC染色結(jié)果

2.2 冠脈流出液中LDH活性檢測(cè)顯示

3組LDH基礎(chǔ)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與基礎(chǔ)值比較，各組在再灌注后LDH活性均升高，IR及MP組在再灌注10 min時(shí)LDH水平達(dá)到最高，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)LDH值逐漸降低；與Sham組比較，IR組在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)LDH值均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=259.35，

P

<0.05)；與IR組比較，MP組再灌注10、60及120 min時(shí)冠脈流出液LDH活性均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=62.52，

P

<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠再灌注后不同時(shí)點(diǎn)冠脈流出液LDH活性的比較

2.3 Western blot結(jié)果顯示

Sham組各時(shí)點(diǎn)間Caspase-3蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Sham組比較，IR組在再灌注后各時(shí)點(diǎn)Caspase-3蛋白表達(dá)中均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=23.38，

P

<0.05)，其中再灌注后60 min時(shí)相對(duì)表達(dá)最高；與IR組比較，MP組可顯著逆轉(zhuǎn)各時(shí)點(diǎn)IR引起的凋亡蛋白Caspase-3的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=77.78，

P

<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 3組大鼠心肌細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的比較

2.4 TUNEL染色結(jié)果顯示

Sham組心肌細(xì)胞凋亡比例均維持在較低水平，雖然隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)有增加的趨勢(shì)，但各時(shí)點(diǎn)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Sham組比較，IR組心肌凋亡比例在再灌注檢測(cè)的各時(shí)點(diǎn)中均顯著升高(

F

=192.11，

P

<0.05)，其中再灌注120 min時(shí)心肌細(xì)胞凋亡比例最高；與IR組比較，MP組在再灌注后心肌凋亡也逐漸增加，但各時(shí)點(diǎn)心肌凋亡比例均較IR組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=84.32，

P

<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 3組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果 HE×400

3 討論

參照參考文獻(xiàn)介紹的方法，該研究采用Langendorff離體心臟灌注裝置制備大鼠全心缺血再灌注模型模擬體外循環(huán)下心臟手術(shù)中心肌缺血再灌注過(guò)程。TTC染色及心肌酶學(xué)檢測(cè)顯示，IR組IS/AAR百分比及LDH水平顯著增加，提示全心缺血再灌注損傷模型建立成功。該研究參照文獻(xiàn)選擇MP的濃度為1 μmol/L，MP組可顯著逆轉(zhuǎn)IR引起的IS/AAR百分比及再灌注5 min 時(shí)LDH水平的升高，這與該課題前期研究結(jié)果一致，提示1 μmol/L MP具有心肌保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷過(guò)程中主要機(jī)制之一，Caspase-3作為細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控因子，抑制再灌注期間Caspase-3蛋白的表達(dá)可以顯著減輕心肌缺血后再灌注損傷。嗎啡作為臨床中經(jīng)典的強(qiáng)效阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥物，不僅可以減輕正常心肌的缺血后損傷，還可以對(duì)病理狀態(tài)下的缺血后心肌發(fā)揮保護(hù)作用。該研究檢測(cè)到MP可以顯著逆轉(zhuǎn)缺血后再灌注后心肌組織各時(shí)點(diǎn)的Caspase-3蛋白表達(dá)水平，同時(shí)降低再灌注后各時(shí)間點(diǎn)心肌細(xì)胞凋亡百分比。該課題前期研究顯示MP減輕全心缺血后損傷與再灌注損傷補(bǔ)救激酶細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)蛋白的表達(dá)升高密切相關(guān)，結(jié)合該實(shí)驗(yàn)后期將進(jìn)一步探討MP的心肌保護(hù)機(jī)制是否經(jīng)阿片受體介導(dǎo)后調(diào)控ERK蛋白激酶，進(jìn)一步抑制Caspase-3等凋亡蛋白的表達(dá)，降低再灌注后心肌細(xì)胞凋亡。Hausenloy et al研究提示再灌注損傷補(bǔ)救激酶ERK蛋白的表達(dá)水平在心肌再灌注后起始階段升高，該研究表明LDH的水平在再灌注初始階段最高，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，同時(shí)Caspase-3蛋白水平在心肌再灌注后60 min內(nèi)逐漸達(dá)到高峰，與之不同的是心肌細(xì)胞凋亡率隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，這提示心肌再灌注早期可能是MP發(fā)揮心肌保護(hù)作用的關(guān)鍵階段。