韓 涵，喻 鑫，周 波, 張宗耀，張培培，劉 弋

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)具有很高的致死率。胃癌的主要治療方法是手術(shù)切除和化療，但晚期胃癌患者的平均生存期不到1年。關(guān)于胃癌發(fā)生發(fā)展、增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制的探索一直是科學(xué)家們致力的方向，但是目前針對(duì)胃癌可用的治療靶標(biāo)仍然很少，進(jìn)一步的研究迫切而必要。順鉑是當(dāng)前治療胃癌的重要化療藥物之一，順鉑耐藥阻礙著它的應(yīng)用。該課題探索了長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)-SNHG4在胃癌細(xì)胞增殖和順鉑耐藥中的作用，同時(shí)明確SNHG4在胃癌患者組織中的表達(dá)及其病理學(xué)意義。

該課題在胃癌細(xì)胞MKN-45和AGS中，構(gòu)建SNHG4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，通過細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)(包括MTT實(shí)驗(yàn)和3-D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn))證明SNHG4對(duì)胃癌增殖生長(zhǎng)和順鉑耐藥的作用；臨床患者組織學(xué)分析證明SNHG4的臨床病理學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

該課題選取胃癌細(xì)胞MKN-45和AGS作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，兩種細(xì)胞均來(lái)自ATCC細(xì)胞庫(kù)(american type culture collection, ATCC)。細(xì)胞培養(yǎng)條件是37 ℃，5% CO。

1.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建

該實(shí)驗(yàn)將SNHG4 DNA全長(zhǎng)序列克隆進(jìn)pSin載體上，進(jìn)一步構(gòu)建慢病毒載體并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系MKN-45 SNHG4和AGS SNHG4，相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞命名為MKN-45 Vec和AGS Vec。實(shí)驗(yàn)方法參照先前文章的報(bào)道，病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)48 h后，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)

該題通過逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA-SNHG4的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)方法參照先前的報(bào)道。GAPDH作為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)中用到的引物包括：SNHG上游引物：5′-GCAGGTGACAGTCTGCATGT-3′，下游引物：5′-TTTTAAGTCCCCTACCCCCATC-3′；GAPDH上游引物：5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′,下游引物：5′-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3′。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn)

該課題通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)操作參照先前文章的報(bào)道，胃癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系及其對(duì)照細(xì)胞MKN-45 SNHG4/MKN-45 Vec、AGS SNHG4/AGS Vec種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔種植細(xì)胞數(shù)為5 000個(gè)，每種細(xì)胞平行重復(fù)3孔，24 h后細(xì)胞培養(yǎng)基換成含0、3、6、12 μg/ml濃度順鉑的培養(yǎng)基，48 h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)OD570吸光度。

1.5 3-D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

該課題通過3-D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)能力。具體實(shí)驗(yàn)步驟包括：24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入200 μl下層基質(zhì)膠，4 ℃冰箱中過夜鋪平，用普通培養(yǎng)基配制8%濃度的基質(zhì)膠，同時(shí)準(zhǔn)備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，單細(xì)胞懸液與8%基質(zhì)膠1∶1混合，基質(zhì)膠終濃度為4%，每孔種植細(xì)胞4 000個(gè)，培養(yǎng)基體積是500 μl，每種細(xì)胞平行重復(fù)3孔，每3 d更換1次細(xì)胞培養(yǎng)基(含4%基質(zhì)膠)，該實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞種植后48 h更換含0.6 μg/ml順鉑的培養(yǎng)基處理細(xì)胞48 h，3-D細(xì)胞培養(yǎng)在第8天進(jìn)行拍照檢測(cè)并定量分析。

1.6 臨床組織標(biāo)本

該課題組收集2018—2019年在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的患者的臨床組織標(biāo)本，包括胃癌組織和癌旁組織各60例，同時(shí)獲取了胃癌患者對(duì)應(yīng)的臨床病理學(xué)特征參數(shù)，包括年齡、性別、腫瘤體積大小、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學(xué)分級(jí)和臨床分期。胃癌患者組織的使用征得了患者的知情許可。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行分析。該課題實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、MTT和3-D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用

t

檢驗(yàn)。SNHG4在組織中的表達(dá)分析以及臨床病理特征相關(guān)性分析均采用χ檢驗(yàn)。

P

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG4對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-45的增殖生長(zhǎng)能力并介導(dǎo)順鉑耐藥影響

該實(shí)驗(yàn)中通過慢病毒載體構(gòu)建了胃癌細(xì)胞MKN-45過表達(dá)lncRNA-SNHG4的細(xì)胞系，命名為MKN-45 SNHG4，相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞命名為MKN-45 Vec。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)比MKN-45 Vec細(xì)胞，MKN-45 SNHG4中的SNHG4水平提高(圖1A)。圖1B顯示，MTT實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)SNHG4的MKN-45細(xì)胞，其細(xì)胞活力升高；在分別加入3、6、12 μg/ml順鉑后，MKN-45 SNHG4和MKN-45 Vec細(xì)胞的細(xì)胞活力均下降，但是與MKN-45 Vec細(xì)胞相比，MKN-45 SNHG4細(xì)胞活力下降的程度降低。3-D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)同樣顯示，MKN-45 SNHG4細(xì)胞的生長(zhǎng)能力高于MKN-45 Vec細(xì)胞；在加入6 μg/ml順鉑后，兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)能力均受到抑制，但與MKN-45 Vec細(xì)胞相比，MKN-45 SNHG4細(xì)胞生長(zhǎng)能力受到的抑制較小[比例變化分別為：-/+(順鉑)MKN-45 Vec細(xì)胞2.68(

P

<0.05), MKN-45 SNHG4細(xì)胞1.84(

P

<0.05)](圖1C)。因此，實(shí)驗(yàn)表明SNHG4促進(jìn)胃癌細(xì)胞MKN-45的增殖生長(zhǎng)能力，并促進(jìn)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥。

圖1 SNHG4對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-45的增殖生長(zhǎng)能力并介導(dǎo)順鉑耐藥的影響

2.2 SNHG4對(duì)胃癌細(xì)胞AGS的增殖生長(zhǎng)能力并介導(dǎo)順鉑耐藥的影響

與MKN-45細(xì)胞相似，該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了胃癌細(xì)胞AGS的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系A(chǔ)GS SNHG4和AGS Vec。與對(duì)照細(xì)胞比較，AGS SNHG4細(xì)胞的SNHG4表達(dá)水平升高(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)(圖2A)；同時(shí)AGS SNHG4細(xì)胞的細(xì)胞活力增加；3、6、12 μg/ml順鉑抑制AGS SNHG4和AGS Vec細(xì)胞的細(xì)胞活力，但是與AGS Vec細(xì)胞相比，AGS SNHG4細(xì)胞活力下降的程度降低(圖2B)。3-D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)同樣顯示，AGS SNHG4細(xì)胞的生長(zhǎng)能力高于AGS Vec細(xì)胞；在加入6 μg/ml順鉑后，兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)能力均受到抑制，但是與AGS Vec細(xì)胞相比，AGS SNHG4細(xì)胞生長(zhǎng)能力受到的抑制較小[比例變化分別為：-/+(順鉑)MKN-45 Vec細(xì)胞2.83(

P

<0.05), MKN-45 SNHG4細(xì)胞1.81(

P

<0.05)](圖2C)。因此，實(shí)驗(yàn)表明SNHG4促進(jìn)胃癌細(xì)胞AGS的增殖生長(zhǎng)能力，并促進(jìn)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥。

圖2 SNHG4對(duì)胃癌細(xì)胞AGS的增殖生長(zhǎng)能力并介導(dǎo)順鉑耐藥的影響

2.3 胃癌組織中SNHG4的表達(dá)分析及其病理學(xué)意義

該實(shí)驗(yàn)收集了60例胃癌組織標(biāo)本和60例癌旁胃組織標(biāo)本，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了SNHG4的表達(dá)水平，隨機(jī)選取3例癌旁胃組織標(biāo)本的SNHG4表達(dá)水平取均值，小于或等于該均值的0.85倍定義為SNHG4低表達(dá)，大于該均值的0.85倍定義為SNHG4高表達(dá)。如表1所示，在癌旁組織中28例(總共檢測(cè)60例)SNHG4高表達(dá)，所占比例為46.7%；在胃癌組織中，42例(總共檢測(cè)60例)SNHG4高表達(dá)，所占比例為70.0%。因此，SNHG4在胃癌組織中相對(duì)于癌旁組織表達(dá)水平升高(

P

=0.01)。同時(shí)，該課題組收集了胃癌組織標(biāo)本對(duì)應(yīng)胃癌患者的病理學(xué)特征參數(shù)，進(jìn)一步通過卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。如表2所示，SNHG4在胃癌組織中的高表達(dá)與患者的腫瘤體積大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理學(xué)分級(jí)具有相關(guān)性，

P

值分別是0.006、0.009和0.031。但是，SNHG4在胃癌組織中的表達(dá)水平與患者的年齡、性別和腫瘤臨床分期無(wú)相關(guān)性。

表1 SNHG4在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)[n(%)]

表2 SNHG4表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征相關(guān)性分析[n(%)]

3 討論

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)具有很高的致死率。盡管目前早期胃癌的發(fā)現(xiàn)率有所提高，但多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期胃癌。針對(duì)中晚期胃癌，治療手段有限，目前仍然是以手術(shù)治療和化學(xué)藥物治療為主，可用于胃癌的分子靶向治療藥物仍然十分有限。當(dāng)前針對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲等機(jī)制的探索仍然是研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。近些年，科學(xué)家們又揭示了許多非編碼RNA在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，比如Qin et al報(bào)道了lncRNA-MDC1-AS通過MDC1依賴的信號(hào)通路在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮抑制增殖和轉(zhuǎn)移的作用；Jin et al報(bào)道了微小RNA(microRNA)-582-5p通過靶向調(diào)節(jié)AKT3基因抑制胃癌細(xì)胞的增殖；Li et al報(bào)道了環(huán)狀RNA-0000096在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮促癌作用。該課題表明lncRNA-SNHG4在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮促癌功能。順鉑是治療胃癌的常用化療藥物，順鉑耐藥阻礙了順鉑在胃癌患者中的應(yīng)用，在先前的報(bào)道中，許多機(jī)制揭示了胃癌順鉑耐藥的原因，其中包括：環(huán)狀RNA-AKT3促進(jìn)PIK3R1表達(dá)、抑制miR-198的作用從而在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)順鉑耐藥的功能；HOXD-AS1調(diào)節(jié)PDCD4和EZH2，從而在胃癌細(xì)胞中促進(jìn)順鉑耐藥；微小RNA-Let-7b通過靶向調(diào)節(jié)AURKB基因抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和順鉑耐藥。因此，胃癌細(xì)胞的順鉑耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，更進(jìn)一步的研究是必要而有意義的。該研究揭示了lncRNA-SNHG4在胃癌細(xì)胞中具有促進(jìn)順鉑耐藥的作用。

lncRNA是一種重要的非編碼RNA，在人類幾乎所有的生理過程中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，許多文獻(xiàn)揭示了lncRNAs在人類腫瘤中起著關(guān)鍵的腫瘤促進(jìn)因子或抑癌因子作用。該課題中研究表明lncRNA-SNHG4能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)并介導(dǎo)化療藥物順鉑的耐藥。在先前的研究中，SNHG4被報(bào)道通過吸附miR-449c-5p和上調(diào)腦缺血再灌注損傷小膠質(zhì)細(xì)胞的STAT6來(lái)減輕炎癥反應(yīng)；SNHG4通過吸附miR-377-3p作用促進(jìn)骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移；SNHG4通過吸附miR-377-3p和調(diào)控miR-138/c-Met信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖、遷移和侵襲；SNHG4通過靶向miR-148a-3p調(diào)節(jié)c-Met促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展；SNHG4通過調(diào)節(jié)miR-98-5p促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲性和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；SNHG4在前列腺癌中也發(fā)揮促癌作用。但是SNHG4在胃癌中的作用仍然研究甚少，該課題研究表明SNHG4在胃癌細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，并介導(dǎo)化療藥物順鉑的耐藥性，該結(jié)論與SNHG4在其他癌種中的功能是一致的，因此，SNHG4在人體多種惡性腫瘤中具有廣泛的促癌作用。

該課題通過MTT檢測(cè)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)和3-D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明了lncRNA-SNHG4在胃癌細(xì)胞中的促癌功能和促進(jìn)順鉑耐藥的作用，受限于研究條件，該研究沒有進(jìn)一步揭示出SNHG4的下游分子機(jī)制，這也是該研究的缺陷，該課題組將在后續(xù)工作中繼續(xù)進(jìn)行深入探索。據(jù)先前的研究報(bào)道，SNHG4靶向吸附miRNA，包括了miR-449c-5p、miR-377-3p、miR-138、miR-148a、miR-98-5p等，進(jìn)一步通過miRNA靶向抑制靶基因(包括c-Met、ZIC5等)的表達(dá)介導(dǎo)其促癌功能，其中包括了骨肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、肺癌和前列腺癌等，但胃癌中尚未見報(bào)道。在胃癌細(xì)胞中，SNHG4很可能也是通過靶向吸附這些miRNA，從而調(diào)節(jié)下游靶基因，這些基因也很可能在胃癌細(xì)胞中介導(dǎo)了胃癌細(xì)胞增殖和藥物耐藥的功能。

該研究收集了臨床胃癌組織標(biāo)本和癌旁正常胃組織標(biāo)本各60例，檢測(cè)SNHG4的表達(dá)水平并作臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析，結(jié)果顯示SNHG4在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織，在胃癌患者中SNHG4的高表達(dá)與患者的腫瘤體積大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理學(xué)分級(jí)具有相關(guān)性。