劉鵬程，張 曄，陳曉宇，趙大海

肺癌的高發(fā)病率和低生存期仍然是目前的難題。尋找抑制癌細胞增殖、遷移，促進癌細胞凋亡的新方法至關重要。MitoQ 是由具有抗氧化作用的輔酶Q 和具有靶向作用的三苯基膦組成。與一般的輔酶Q相比，MitoQ可以在線粒體中大量積累，從而保護線粒體免受氧化應激損傷。研究表明，MitoQ在多種疾病的治療過程中發(fā)揮重要作用，如帕金森病、缺血再灌注損傷等，同時隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明MitoQ參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展及誘導腫瘤細胞凋亡。線粒體自噬包括PINK1(PTEN induced putative kinase 1)/Parkin、BNIP3L(protein 3-like protein)/Nix和FUNDC1(FUN14 domain containing 1)等多條途徑，研究表明在多種疾病中都存在線粒體自噬功能的失調(diào)。然而，截止目前，MitoQ作用癌細胞的機制仍不清晰，因此，尋找其中的分子機制對改善患者的預后具有重要意義，該研究擬采用不同濃度的MitoQ體外作用A549細胞，探討MitoQ在肺腺癌細胞中所發(fā)揮的功能機制，期望為肺癌的治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 細胞

人肺腺癌A549細胞購自廣東吉尼歐生物技術有限公司。

1.2 主要試劑

MitoQ購自美國ABMole公司, DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國HyClone公司，DAPI溶液、RIPA強裂解液均購自北京索萊寶科技有限公司，NIX抗體購自英國abcam公司，p62抗體、Bax抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司，ECL超敏發(fā)光液購自美國PIERCE公司。

1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本Sanyo公司；酶聯(lián)免疫分析、電泳儀器均購自美國Bio-Rad公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.4 細胞培養(yǎng)

A549細胞用含10%胎牛血清和100 U/ml的青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO下培養(yǎng)。當細胞生長到對數(shù)生長期時用PBS清洗細胞，使用胰酶消化細胞1 min,以1 000 r/min離心5 min后收集細胞，棄去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基重懸。將細胞分到新的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力

用胰酶消化收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞密度，96孔板每孔加入100 μl細胞懸液，使細胞密度為4×10/孔左右。同時設置無細胞的對照組，放入CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞完全貼壁后加入不同濃度的MitoQ(0、0.125、0.25、0.5、1、2、5、10、20 μmol/L)處理12 h，更換新鮮培養(yǎng)基后每孔加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1 h后使用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。實驗重復3次。細胞存活率=[(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]× 100%。

1.6 細胞劃痕實驗測定A549細胞的遷移能力

將A549細胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿時，沿中心軸方向，用200 μl微量吸管在培養(yǎng)基表面劃線，用PBS清洗3次，加入含有不同濃度MitoQ(0、10 μmol/L)的無血清DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，于固定位置用顯微鏡拍照并計算細胞遷移率(傷口愈合百分比)。細胞遷移率=(0 h劃痕面積-12 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.7 Western blot檢測NIX、p62、Bax的表達

將A549細胞接種于6孔板中培養(yǎng)。加入含有不同濃度MitoQ(0、0.5、1、2、5、10 μmol/L)的培養(yǎng)基處理細胞12 h后。用4 ℃ PBS洗滌細胞3次，然后用細胞刮鏟均勻收集培養(yǎng)皿中的細胞，加入蛋白裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF裂解細胞，并使用4 ℃離心機離心，收集蛋白上清液分裝，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。用SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)并轉移到PVDF膜上。膜用5%脫脂牛奶封閉1 h后，與抗Bax(1∶500)、抗p62(1∶500)、抗NIX(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，室溫下孵育辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(1∶2 500)1 h，最后用ECL試劑曝光條帶，ImageJ測定目的條帶和內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值，實驗重復3次。

2 結果

2.1 MitoQ抑制A549細胞增殖能力

不同濃度的MitoQ處理A549細胞12 h后，采用CCK-8檢測試劑盒測定A549細胞在相應藥物濃度下的細胞活性。如圖1所示，與對照組比較，MitoQ抑制了A549細胞的增殖。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，細胞活力差異有統(tǒng)計學意義(

F

=97.366,

P

<0.001)。

圖1 不同濃度MitoQ對A549細胞增殖的影響

2.2 MitoQ抑制A549細胞遷移能力

如圖2、3所示，使用不同濃度的MitoQ(0、10 μmol/L)作用A549細胞12 h，與對照組(0 μmol/L)比較，MitoQ組(10 μmol/L)顯著抑制了A549細胞的遷移能力(

P

<0.05)。對照組細胞遷移能力為(41.4±5.8)%，MitoQ組(10 μmol/L)細胞遷移能力降至(20.7±2.7)%，數(shù)據(jù)采用獨立樣本

t

檢驗，

t

=-5.628，

P

=0.005，細胞遷移能力差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.01)。

圖2 不同濃度MitoQ對A549細胞遷移能力的影響 ×200

圖3 不同濃度MitoQ對A549細胞遷移能力的影響

2.3 MitoQ可以上調(diào)A549細胞自噬從而誘導A549的凋亡

如圖4所示，該課題組研究了MitoQ(0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μmol/L)處理A549細胞12 h后NIX、p62、Bax等自噬及凋亡相關蛋白的變化，Western blot結果顯示，自噬相關蛋白NIX及凋亡相關蛋白Bax在MitoQ組中的表達呈劑量依賴性增加，自噬蛋白p62表達下降。MitoQ以劑量依賴的方式上調(diào)細胞自噬誘導細胞凋亡。數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，蛋白表達量差異有統(tǒng)計學意義，其中NIX蛋白組

F

=31.098，

P

<0.001；Bax蛋白組

F

=38.923，

P

<0.001；p62蛋白組

F

=34.600，

P

<0.001。

圖4 不同濃度MitoQ對A549細胞自噬和凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署(international agency for research on cancer, IARC)2018年發(fā)布的癌癥報告，肺癌的發(fā)病率和病死率均高居惡性腫瘤首位。因此，明確肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制和途徑，尋找能夠抑制癌細胞增殖，減少其侵襲和轉移并最終促進癌細胞凋亡的方法是治療肺癌的重要突破口。作為一種特殊的自噬形式，線粒體自噬利用自噬溶酶體特異性的清除異常的線粒體，參與細胞的能量及物質(zhì)代謝。線粒體在正常新陳代謝中產(chǎn)生大量活性氧。對于正常組織和細胞而言，線粒體ROS由于受到抗氧化體系的調(diào)控而處于較低水平。然而在腫瘤細胞中，由于線粒體的功能障礙，癌細胞比正常細胞具有更高的ROS水平，這在很大程度上促進了癌癥的發(fā)展。癌細胞的線粒體結構和功能發(fā)生改變使其對特定的分子更敏感，因此，針對線粒體的靶向藥物是一類比較有應用潛力的抗癌藥。

目前MitoQ誘導的線粒體自噬可以誘導超氧化物的產(chǎn)生進而導致細胞凋亡，并且在癌癥的治療上也具有明顯的效果。課題組前期預實驗的研究結果也表明MitoQ可以明顯抑制A549細胞的生長，差異有統(tǒng)計學意義。然而，大型隨機臨床試驗和一些生物學研究提出了相互矛盾的結果。自噬作為一把“雙刃劍”，它既可以通過破壞細胞的營養(yǎng)和能量代謝來抑制腫瘤的發(fā)展，也可以通過賦予腫瘤細胞抵抗氧化應激的優(yōu)勢來促進腫瘤的進展，目前已有研究表明抗氧化劑本身會產(chǎn)生不良影響，如促進黑色素瘤的發(fā)生。通過大量使用抗氧化劑來地毯式的清除細胞內(nèi)的ROS是有害的，因為它們不能在特定的生成部位特異性的清除ROS。因此，線粒體靶向抗氧化劑MitoQ在抗癌方面可能具有一定的的優(yōu)勢。

該研究利用不同濃度的MitoQ作用人肺腺癌細胞12 h后，在倒置顯微鏡中觀察到MitoQ組較對照組細胞形態(tài)偏圓，細胞密度降低，提示肺癌細胞可能發(fā)生了凋亡，CCK-8實驗顯示MitoQ可顯著抑制A549細胞的增殖，通過無血清DMEM培養(yǎng)基在抑制A549細胞增殖的背景下進行了細胞劃痕實驗，結果顯示其可顯著抑制肺癌細胞的遷移，體外實驗表明MitoQ具有良好的抗癌活性，隨后通過Western blot半定量檢測自噬及凋亡蛋白的表達情況，結果顯示自噬相關蛋白NIX表達上調(diào)，p62表達下調(diào)，凋亡相關蛋白Bax表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)，BNIP3L位于線粒體外膜，不僅可以通過Parkin-p62通路調(diào)節(jié)Parkin中的位移，然后激活細胞自噬，而且還可作為自噬受體與Atg8家族蛋白直接結合，將自噬體的前體招募到線粒體上。Bax是線粒體自噬過程中的一個重要分子，屬于Bcl-2家族，同時也被認為是促凋亡蛋白。p62 蛋白能通過電壓依賴性陰離子通道蛋白1(volt age-dependent anion channel 1 protein，VDAC1)經(jīng)p62-LC3進入自噬-溶酶體系統(tǒng)降解。自噬增強時p62蛋白被降解增多，自噬減弱時，p62 蛋白降解減少，在胞質(zhì)中蓄積。同時p62蛋白還作為一個重要的caspase-8細胞凋亡的調(diào)節(jié)器。該研究表明，MitoQ組NIX、Bax蛋白表達增強，提示相對于對照組，MitoQ組細胞的自噬及自噬流增強，Bax蛋白表達上調(diào)，caspase家族活化，細胞凋亡增加。與此同時，目前主流科學界認為NiX介導的線粒體自噬機制主要包括以下幾個方面，通過與 Parkin相互作用介導線粒體自噬；Nix作為自噬受體招募Atg8蛋白家族啟動線粒體自噬；Nix增加細胞質(zhì)中游離的 Beclin-1誘導自噬。在肺癌中，NIX蛋白介導的線粒體自噬增強的具體通路及線粒體自噬與凋亡間的具體聯(lián)系仍不清晰，且鮮有文獻報道。在后續(xù)研究中，該課題組將進一步在其他細胞系中體外驗證實驗結果，動物荷瘤實驗也將同步展開，聯(lián)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、非編碼RNA等進一步探討MitoQ影響線粒體自噬及凋亡的具體分子通路。