馮 陽，賀 凡，涂珍珍，臧丹丹，倪鳴岳，周海勝,

G蛋白偶聯(lián)受體107(G protein-coupled receptor 107，GPR107)是G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，因尚未找到其天然配體，屬于孤兒受體。人類GPR107的cDNA最先從肺組織中獲得克隆。GPR107蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示其N-末端存在疏水的信號肽和7個跨膜區(qū)，這是G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員的典型特征。GPR107在系統(tǒng)發(fā)育上高度保守，有研究表明GPR107與網(wǎng)格蛋白和逆轉(zhuǎn)錄蛋白VPS35結(jié)合，并且可能負責受體從內(nèi)細胞室返回質(zhì)膜，GPR107可能是與G蛋白結(jié)合以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)囊泡運輸?shù)氖荏w之一。

為了過量表達GPR107蛋白并確定其亞細胞定位，利用分子克隆技術構(gòu)建質(zhì)粒pCMV-Tag2B-GPR107，將其轉(zhuǎn)染至人胚腎上皮細胞(HEK 293T)，通過Western blot、激光共聚焦等方法，觀察轉(zhuǎn)染前后GPR107在體內(nèi)的表達變化及其亞細胞分布，為進一步研究GPR107的功能及作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

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細胞系與載體 人胚胎腎細胞系293T細胞在該實驗室保存；真核細胞表達載體pCMV-Tag-2B購自美國Promega公司；克隆載體pMD-18T購自大連寶生物有限公司；自人cDNA文庫中獲得GPR107 cDNA的質(zhì)粒(克隆號：23329)由廈門大學韓家淮教授惠贈。

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引物 根據(jù)韓家淮教授實驗室提供人GPR107基因的mRNA序列，利用Primer-BLAST在線軟件進行引物設計。根據(jù)真核表達載體pCMV-Tag 2B多克隆位點的限制性核酸內(nèi)切酶，在上游和下游引物的5′端分別引入限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind III的識別序列及其保護堿基。使用的引物序列為：上游引物P1，5′-CGCGGATCCGCGATGGCCGCTCTGGCGC-3′(紅色表示BamH I識別位點)；下游引物P2，5′-CCCAAGCTTGGGCACGGCGCCTTCCCAC-3′(紅色表示Hind Ⅲ識別位點)。引物由上海生物工程有限公司合成。

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主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素雙抗混合液、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自美國Corning公司；Taq酶、PCR試劑盒、DNA Marker均購自日本TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑I′mafect購自北京Imagen公司；鼠源抗GPR107和兔源抗GAPDH抗體均購自安徽朵能生物科技有限公司；兔源抗Flag抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 方法

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載體構(gòu)建 按1∶150擴增含GPR107 cDNA的質(zhì)粒菌液，培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒DNA為模板，采用PCR方法擴增GPR107 cDNA。PCR的條件是：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、100 s，72 ℃、5 min，共35個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳分離目的DNA，切膠回收目的片段，與pMD18-T Vector連接構(gòu)建重組克隆載體，利用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ消化pCMV-Tag 2B載體和重組的克隆載體，切膠回收目的DNA，用T4 DNA連接酶連接GPR107目的片段和pCMV-Tag 2B載體，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中，平板克隆后挑取菌落擴大培養(yǎng)，PCR鑒定，提取質(zhì)粒，經(jīng)BamH Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切后，選取酶切鑒定條帶位置一致的克隆，送上海生物工程股份有限公司測序。

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細胞培養(yǎng) 人胚胎腎細胞系293T使用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于5% CO、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

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重組質(zhì)粒pCMV-Tag2B-GPR107瞬時轉(zhuǎn)染細胞 293T細胞以1×10接種于60 mm培養(yǎng)皿，待其貼壁后長至70%～80%密度后進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO培養(yǎng)，同時配置轉(zhuǎn)染工作液，脂質(zhì)體與DNA的比例為1∶1.5，即將4 μl I′mafect轉(zhuǎn)染試劑稀釋至100 μl不含血清的培養(yǎng)液中輕輕混勻、6 μg DNA稀釋至100 μl不含血清的培養(yǎng)液中輕輕混勻，室溫放置5 min后，將I′mafect稀釋液逐滴加入DNA稀釋液中，輕輕混勻后室溫放置20 min，將200 μl轉(zhuǎn)染工作液逐滴加入293T培養(yǎng)液中，6 h后更換含10% FBS的高糖DMEM，培養(yǎng)48 h后收取蛋白。

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Western blot實驗 轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞總蛋白。制備10%的SDS-PAGE凝膠，上樣后80 V恒壓待濃縮膠平齊后，120 V恒壓至最底端，恒流200 mA、90 min轉(zhuǎn)膜，4 ℃封閉5 h，4 ℃過夜孵育一抗GPR107(1∶2 000)、GAPDH(1∶5 000)。次日TBST洗滌3次,每次10 min，4 ℃ HRP標記的二抗孵育3 h，TBST洗滌3次后，ECL發(fā)光試劑反應，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，最后用Image J軟件對目的條帶進行灰度分析。

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激光共聚焦實驗 先將pCMV-Tag2B-GPR107瞬時轉(zhuǎn)染細胞至293T細胞，待24 h后取20%左右已經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞鋪至玻底培養(yǎng)皿，待細胞貼壁，24 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，0.3% Triton X-100透化劑透化，加入3%馬血清封閉1 h，一抗(兔源抗Flag)4 ℃孵育過夜，使用帶熒光標記Alexa Flour 647的二抗4 ℃孵育2 h，室溫染核10 min，激光共聚焦顯微鏡觀察、拍片。

2 結(jié)果

2.1 pCMV-Tag2B-GPR107載體構(gòu)建結(jié)果

利用人cDNA文庫中獲得的GPR107 cDNA質(zhì)粒為模板，通過PCR獲得人GPR107 cDNA(圖1A)，GPR107目的片段長度為1 659 bp，連接到克隆載體pMD18-T Vector上并將其菌液進行PCR鑒定。PCR結(jié)果顯示，提取的10個克隆中有7個克隆為陽性重組載體(圖1B)。將2號克隆進行擴增、提取質(zhì)粒DNA、BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，獲得與目的片段大小一致的DNA(圖1C)。將此目的DNA亞克隆到帶有Flag標簽的pCMV-Tag2B載體并進行PCR鑒定，篩選出4個陽性的重組表達載體(圖1D)，選取2號克隆進行DNA測序，將測序結(jié)果與原cDNA序列進行比對，實驗表明目的基因無突變且表達框無誤以及pCMV-Tag2B-GPR107載體構(gòu)建成功。

圖1 pCMV-Tag2B-GPR107載體構(gòu)建

2.2 重組質(zhì)粒pCMV-Tag2B-GPR107轉(zhuǎn)染293T細胞后蛋白表達量變化

為了在細胞水平檢測GPR107的表達量變化，將pCMV-Tag2B-GPR107重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細胞，48 h后提取蛋白，結(jié)果顯示：未轉(zhuǎn)染組GPR107蛋白相對表達量為0.28，F(xiàn)lag蛋白相對表達量為0.31，轉(zhuǎn)染組GPR107蛋白相對表達量為0.59，F(xiàn)lag蛋白相對表達量為0.81，故與未轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染了pCMV-Tag2B-GPR107的實驗組GPR107的蛋白量明顯上調(diào)(

F

=28.408，

P

=0.033)；同樣轉(zhuǎn)染組Flag蛋白量也明顯上調(diào)(

F

=87.433，

P

=0.011)(圖2)。

圖2 Western blot檢測GPR107在293T細胞中的表達量

2.3 激光共聚焦顯微鏡實驗結(jié)果

為了檢測GPR107在細胞內(nèi)的定位情況，將pCMV-Tag2B-GPR107轉(zhuǎn)染293T細胞，于激光共聚焦顯微鏡下觀察GPR107細胞內(nèi)的分布情況，圖3結(jié)果顯示GPR107主要分布在細胞質(zhì)中。

圖3 GPR107在293T細胞中的定位 ×640

3 討論

GPR107是最早從哺乳動物肺中克隆到的cDNA，屬于一個新的編碼蛋白家族的成員。人類GPR107基因位于9q34.11的常染色體區(qū)域，基因全長86.4 kb，包含18個外顯子。其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析提示疏水信號肽序列位于氨基末端、一個較長的胞外結(jié)構(gòu)域和7個跨膜結(jié)構(gòu)域(LUSTR結(jié)構(gòu)域)，這7次跨膜結(jié)構(gòu)域與GPCRs相似，位于羧基末端。而在每個LUSTR亞家族中，第3個細胞內(nèi)環(huán)高度保守，通常在其他GPCR的第3個細胞內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)域參與G蛋白結(jié)合和受體信號傳遞，表明LUSTR蛋白的這一區(qū)域也參與G蛋白偶聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導過程。因此，確定GPR107在細胞中的分布，為證實GPR107羧基末端對其細胞定位及轉(zhuǎn)運過程中的作用奠定基礎。

為了確定GPR107蛋白在細胞內(nèi)分布，該研究構(gòu)建了人GPR107的真核表達載體，在轉(zhuǎn)染293T細胞后獲取總蛋白進行Western blot分析，結(jié)果顯示GPR107在人293T細胞中成功過量表達。GPR107是具有7個跨膜的蛋白，既往研究表明GPR107的主要功能可能是與G蛋白結(jié)合以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)囊泡運輸。而富含囊泡的亞細胞器結(jié)構(gòu)主要是分布于細胞質(zhì)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，免疫熒光共定位結(jié)果顯示GPR107在細胞內(nèi)表達主要在細胞質(zhì)中，而在細胞核中未見GPR107的表達，這與文獻報道的GPR107定位于高爾基體與核質(zhì)有差異，可能與GPR107表達的細胞種類有關。

既往研究表明，GPR107可能是一種神經(jīng)生長抑素的候選受體，通過與神經(jīng)生長抑素相互作用，在心血管功能的中樞調(diào)控中發(fā)揮重要作用，而且GPR107在胰腺組織中具有較高的表達水平。研究表明，在小鼠和人胰腺細胞上GPR107和神經(jīng)生長抑素可以發(fā)生共定位，可能參與胰腺分泌進而影響消化系統(tǒng)的功能。此外，有報道GPR107在肝癌和前列腺癌組織中具有較高表達水平，提示GPR107可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。故GPR107在293T細胞中的過表達或許也是與腫瘤有關，具體機制有待進一步研究。

GPR107在高等真核生物中普遍的表達和保守模式使得GPR107可能屬于在高爾基體中協(xié)調(diào)G蛋白依賴事件的GPCRs。通過成功構(gòu)建人GPR107的真核表達載體，研究表明能在293T細胞中過量表達，并主要分布在細胞質(zhì)中，為后續(xù)研究其作用機制奠定基礎。同時，需要對GPR107在不同細胞中表達定位的差異性與GPR107的功能及其作用機制進行更深入研究。