文志勇，劉偉華，譚松齡，冉 云，陳 杰，肖 娜，江麗萍，李 興，陳衛(wèi)國，文劍波

（贛南醫(yī)學(xué)院附屬萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，江西 萍鄉(xiāng) 337000）

肝硬化是由不同肝損傷機制引起的壞死性炎癥和纖維化，組織學(xué)特征為彌漫大小不一的假小葉形成。當(dāng)肝硬化發(fā)展為臨床失代償期，1 年的死亡率為1%～57%不等，全球每年導(dǎo)致103萬人死亡［1］。失代償肝硬化患者發(fā)生急、慢性肝功能衰竭（ACLF）等并發(fā)癥與較高的醫(yī)療費用相關(guān)，包括感染、腹水、門靜脈血栓形成、手術(shù)、肝細胞癌和肝昏迷［2］。有研究發(fā)現(xiàn)在肝硬化患者中腸道損害包括紅斑、糜爛、血管擴張、靜脈曲張和絨毛水腫（7%）［3］。在肝硬化大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)腸道大量破壞、炎癥浸潤黏膜上皮、腺上皮中的圓柱形結(jié)構(gòu)消失、絨毛嚴重腫脹和黏膜結(jié)構(gòu)松散［4］。腸道細菌易位（Bacterial translocation，BT）在肝硬化并發(fā)癥的發(fā)病機制中起重要作用，而腸上皮屏障在肝硬化患者抗BT生理功能的維持中起重要作用。在病理條件下，腸上皮屏障完整性破壞導(dǎo)致腸上皮屏障功能障礙，從而促進BT，導(dǎo)致失代償性肝硬化［5］。

胃腸道（GI）是活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的主要來源，而活性氧與許多胃腸道疾病有關(guān)［6］。過度的氧化應(yīng)激將導(dǎo)致腸道炎癥和腸黏膜上皮細胞凋亡，從而進一步損害腸黏膜屏障［6］。有研究發(fā)現(xiàn)肝硬化大鼠，特別是具有腹水和細菌易位的大鼠，在回腸和盲腸黏膜中氧化應(yīng)激ROS 產(chǎn)物丙二醛水平升高，且與門脈壓力之間存在直接相關(guān)性［7］。

核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子（Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是細胞針對環(huán)境應(yīng)激應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)器。在腸道應(yīng)激條件下，Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）誘導(dǎo)Nrf2 磷酸化從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核，從而激活解毒和抗氧化酶的表達。Nrf2 靶基因包括編碼血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）、抗氧化酶、藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體的基因［8］。Nrf2/HO-1 通路在抵抗嚴重的腸道黏膜氧化損傷中起關(guān)鍵作用。用葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulphate sodium，DSS）處理6 d的Nrf2基因缺陷小鼠，結(jié)腸組織中的脂質(zhì)過氧化水平顯著高于野生型小鼠，包括丙二醛和4-羥基烯［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，與健康人類相比，潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）患者結(jié)腸炎癥組織中Nrf2 基因的表達水平升高，且UC 患者結(jié)腸組織中谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的表達也增加［10］。

氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）是一種源自傳統(tǒng)中草藥苦參的喹嗪生物堿，具有廣泛的藥理學(xué)活性。研究證明OMT 可通過RNA 干擾技術(shù)將病毒pgRNA 包裝到核衣殼中或抑制病毒DNA 聚合酶的活性來抑制肝炎病毒的復(fù)制［11-12］。其抗氧化活性已用于治療肝纖維化、急性肝衰竭、皮膚疾病、心臟毒性、胃潰瘍和肺動脈高壓［13-16］。有研究發(fā)現(xiàn)OMT 可能在急性肝衰竭（ALF）中參與Nrf2/HO-1 通路的活化，減輕肝纖維化［13］。我們已經(jīng)證明，氧化苦參堿可通過調(diào)節(jié)NF-κB 介導(dǎo)的信號通路來改善肝硬化腸屏障功能，從而減少炎癥［4］。然而，OMT是否通過Nrf2/HO-1 通路改善肝硬化腸屏障功能尚不清楚。因此，我們在具備腸黏膜損害的肝硬化大鼠模型中，研究OMT 治療是否能夠激活腸道Nrf2/HO-1 通路減輕腸道氧化應(yīng)激損傷，維持腸道屏障完整性。

1 材料和方法

1.1 動物及材料28 只雄性SD 大鼠（200～250 g）購自長沙斯萊克景達實驗動物有限公司。將所有動物飼養(yǎng)在含木屑的塑料籠中，并在22 ℃～25 ℃的房間中飼養(yǎng)，12 h 光照/夜間循環(huán)，自由獲取標(biāo)準(zhǔn)實驗室飼料和水。動物研究方案獲得本院動物實驗倫理委員會的批準(zhǔn)（批號：BE201602132，批準(zhǔn)日期：2019-8-6）。主要實驗材料包括：CCl4分析純?nèi)芤海?00 mL/瓶，國藥集團化學(xué)藥業(yè)公司），苦參素注射液（正大天晴藥業(yè)公司），GSH 試劑盒、MDA試劑盒、CAT 試劑盒（碧云天），SOD試劑盒、T-AOC試劑盒（上海素爾實驗技術(shù)公司），核蛋白分離試劑盒（Merk），Nrf2（Avivasysbio， OAAJ03246，1∶500）、P-Nrf2（Avivasysbio，OABF00897，1∶200）、HO-1（Abcam，ab13243，1∶100）、Claudin 4（Abcam，ab53156，1∶500）、H3（Abcam，ab1791，1∶4 000）及GAPDH（Abcam，ab125247，1∶4 000），HRP-羊抗鼠IgG（boster，1∶5 000）。

1.2 方法

1.2.1 分組 SD大鼠隨機分為3 組：正常大鼠為空白對照組（Control 組）、具備腸屏障破壞的肝硬化模型組（Model 組）和氧化苦參堿治療肝硬化大鼠實驗組（OMT 組）。實驗方案分兩步：模型制備期、動物實驗期。

1.2.2 模型制備期在模型制備階段，隨機選取20 只SD 大鼠作為模型制備鼠，模型制備方法為皮下注射40% CCl4濃液（2∶3 橄欖油混合物），注射劑量為0.3 mL·kg-1，每周2 次，共12 周。密切觀察各組肝硬化模型大鼠進食、進水、活動量、皮毛及體重變化，大鼠重量下降超過10 g 時，暫停模型方案，自由進食及飲水，待體重恢復(fù)到減輕小于10 g后，再繼續(xù)造模方案［17-18］。在模型制備期間，于4、8、12 周分別隨機抽取1 只大鼠處死，取肝臟行病理檢查以觀察肝臟硬化進展情況，取回腸末端組織行病理檢查觀察腸道屏障破壞情況。經(jīng)病理切片驗證，共成功制備出肝硬化合并有腸道黏膜屏障破壞模型大鼠16只。

1.2.3 動物實驗期實驗組大鼠根據(jù)體重肌注生理鹽水配制的OMT注射液，劑量為6.3 mg·100 g-1，持續(xù)4 周，每天1 次；正常對照組、肝硬化模型組大鼠則根據(jù)體重肌注生理鹽水溶液（0.5 mL·100 g-1），持續(xù)4 周，每天1 次；動物實驗前測量每只大鼠體重作為原始體重，實驗中監(jiān)測各組大鼠體重，每周2次，使用體重百分比用于統(tǒng)計體重變化，體重百分比=所測體重/原始體重×100%。為有效防止模型及治療組大鼠在實驗期間肝硬化緩解，在動物實驗13～16 周期間，模型組及實驗組大鼠將繼續(xù)予以濃度為40% CCl4橄欖油溶液皮下注射（注射劑量為0.3 mL·kg-1），每周2 次。如果體重下降10%或出現(xiàn)明顯的癥狀，如黏膜蒼白、顫抖、對刺激反應(yīng)遲鈍、勃起毛發(fā)蓬亂、發(fā)聲困難，大鼠將被處死。在16周，所有大鼠使用高濃度的二氧化碳麻醉安樂死。收集回腸末端組織（5 cm）標(biāo)本保存，做進一步分析。

1.3 組織病理學(xué)收集回腸末端標(biāo)本（5 cm）進行常規(guī)組織病理學(xué)檢查。病理醫(yī)師在光鏡下（Nikon Eclipse 50i；Kanagawa，日本）觀察黏膜損傷?；啬c黏膜損傷的病理指標(biāo)包括：腸上皮結(jié)構(gòu)紊亂、黏膜層破壞、絨毛萎縮、腺體減少、上皮及肌層炎性細胞浸潤等。

1.4 氧化應(yīng)激評價將組織樣品在裂解緩沖液中均漿后離心（10 000 g，4°C）10 min 以分離上清液，上清液用于測定抗氧化酶及MDA水平檢測。使用 試 劑 盒（BioVision Scientific INC，Shanghai，China）根據(jù)生產(chǎn)商說明書測定腸道超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）和總抗氧化能力（T-AOC）的含量。

1.5 Western-blot 分析使用試劑盒（NucBuster TM蛋白提取試劑盒，Merckmipore，貨號：71183-3）根據(jù)生產(chǎn)商說明書提取回腸末端組織細胞質(zhì)及細胞核蛋白。根據(jù)市售試劑盒提取回腸末端組織細胞蛋白，BCA 試劑盒蛋白定量，以每孔20 μg 總蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至NC 膜中。T-TBS 漂洗，5%脫脂牛奶封閉2 h，T-TBS漂洗，一抗4°C 孵育過夜，T-TBS 漂洗，二抗室溫孵育1 h，T-TBS 漂洗，ECL 顯色。用Imag J 分析目的蛋白條帶和內(nèi)參條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0 進行分析。GraphPad Prism（美國，GraphPad 軟件）進行繪圖。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝硬化腸道屏障破壞模型制備鏡下改變在模型制備期間，于4、8、12 周分別隨機抽取1 只大鼠行肝臟及末端回腸行病理檢查以觀察肝臟及腸道上皮屏障硬化進展情況。鏡下觀察顯示，4 周大鼠可見肝臟肝細胞均勻排列，無假小葉形成，可見正常肝竇、匯管區(qū)及膽管。腸上皮形態(tài)維持基本完整。8 周肝臟明顯彌漫性纖維基質(zhì)增多，增生的致密纖維化隔膜將肝細胞重新包繞，形成假小葉。腸上皮形態(tài)受到不同程度破壞，上皮絨毛出現(xiàn)斷裂，不同程度炎性細胞浸潤。12 周肝臟除可見假小葉形成外，還可見肝實質(zhì)消退和肝臟周圍組織結(jié)構(gòu)塌陷，肝臟血管結(jié)構(gòu)明顯扭曲，肝細胞排列紊亂，脂肪細胞浸潤，肝細胞壞死。12 周腸黏膜上皮屏障形態(tài)嚴重破壞，絨毛萎縮、斷裂，炎性細胞浸潤。由此可見具備腸黏膜屏障破壞的大鼠肝硬化模型建立成功。見圖1。

圖1 具有腸黏膜破壞肝硬化模型制備4、8、12周肝臟及腸道HE染色

2.2 OMT 治療能夠增加肝硬化大鼠體重為觀察OMT 治療后對肝硬化大鼠體重的影響，3 組大鼠在13～16 周每周監(jiān)測體重2 次，使用體重百分數(shù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，與模型組相比，實驗組肝硬化大鼠體重百分比增加更多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 3組大鼠體重百分比統(tǒng)計分析

2.3 OMT 改善CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大鼠回腸組織的組織學(xué)變化空白對照組大鼠的回腸組織可見黏膜（Mucosa，m）和黏膜肌層（Muscularis mucosae，mm）（圖3A，圖3D）。在肝硬化模型大鼠中，腸黏膜層已被大量破壞，伴有萎縮、較短和斷裂的絨毛，炎癥細胞浸潤至固有層和肌層，上皮腺體減少以及黏膜結(jié)構(gòu)松散（圖3B，圖3E）。而經(jīng)OMT 治療后，實驗組腸黏膜絨毛修復(fù)，黏膜完整性得到改善。腺上皮中圓柱狀結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著增加（圖3C，圖3F）。提示OMT可修復(fù)肝硬化大鼠腸屏障損傷。

圖3 3組大鼠回腸HE染色

2.4 OMT 降低了肝硬化大鼠回腸黏膜屏障的氧化應(yīng)激損傷與模型組肝硬化大鼠相比，實驗組大鼠抗氧化酶SOD、CAT、GSH、T-AOC 和HO-1 的表達顯著增加，MDA含量顯著降低。見表1、圖4。

圖4 3組大鼠抗氧化酶（SOD、CAT、GSH、T-AOC、MDA）及HO-1表達條帶灰度值比較

表1 3組大鼠抗氧化酶（SOD、CAT、GSH、T-AOC、MDA）及HO-1的表達/±s

表1 3組大鼠抗氧化酶（SOD、CAT、GSH、T-AOC、MDA）及HO-1的表達/±s

注：a：對照組vs模型組，P＜0.000 1；b：模型組vs實驗組，P＜0.05；c：模型組vs實驗組，P＜0.000 1；d：模型組vs實驗組，P＜0.001。

HO-1 DPI 0.86±0.36 0.21±0.11 0.37±0.21d 17.29組別對照組模型組實驗組F值SOD/U·mg-1 1.81±0.47 0.57±0.12a 0.95±0.20b 35.14 CAT/U·mg-1 12.86±3.55 3.53±1.19a 6.91±1.08b 35.35 GSH/uM·mg-1 186.7±27.48 51.15±11.09a 111.2±15.9c 97.97 T-AOC/mmol·μL-1 0.13±0.012 0.04±0.01a 0.07±0.01c 119.5 MDA/μmol·mg-1 1.61±0.32 7.08±1.22a 3.98±0.93c 73.48

2.5 OMT 治療能夠影響肝硬化大鼠腸道Nrf2/HO-1通路p-Nrf2 蛋白的表達在細胞質(zhì)和細胞核中均顯著增加，Nrf2的表達在細胞核中也顯著增加，Nrf2在細胞質(zhì)中的表達無差異。進一步檢測結(jié)果表明，細胞質(zhì)、細胞核p-Nrf2/總Nrf2 蛋白經(jīng)OMT 治療后，在細胞質(zhì)及細胞核pNrf2/總Nrf2 比值均升高，提示OMT 能夠促進細胞質(zhì)Nrf2 活化為磷酸化Nrf2。見圖5、圖6。

圖5 3組大鼠胞質(zhì)及胞核中Nrf2、p-Nrf2 的表達

圖6 3組大鼠胞質(zhì)及胞核Nrf2、p-Nrf2表達條帶灰度值比較

3 討 論

由于肝硬化的各種并發(fā)癥的嚴重性，臨床醫(yī)生不斷探索有效的治療方法，以改善患者生活質(zhì)量并降低治療費用。腸上皮屏障功能破壞、腸道細菌的過度生長和易位在肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)病機制中起重要作用［19-20］。然而，腸上皮屏障功能的破壞可能是腸道細菌移位的始動因素。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)OMT 可恢復(fù)CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大鼠腸上皮屏障的完整性和功能。這些獲益至少部分可歸因于OMT 通過影響Nrf2/HO-1信號通路減輕腸道氧化應(yīng)激損害。

在肝硬化患者中，腸道異常較為常見。一項研究［3］發(fā)現(xiàn)，代償期肝硬化患者中67%存在小腸異常，包括紅斑（53%）、糜爛（17%）、血管擴張（15%）、靜脈曲張（7%）和絨毛水腫（7%）。在組織學(xué)形態(tài)學(xué)改變中，CCl4誘導(dǎo)的肝硬化大鼠腸道大量破壞、炎癥細胞浸潤固有層和肌層、腺上皮的圓柱形消失、絨毛嚴重腫脹和黏膜結(jié)構(gòu)松散［4-5］。在本研究中，我們觀察到相似的形態(tài)學(xué)變化，經(jīng)OMT 治療后可修復(fù)肝硬化大鼠腸道形態(tài)學(xué)改變以維持腸上皮屏障的完整性。

胃腸道過度生成活性氧（Reactive oxygen species，ROS）將破壞腸黏膜屏障［6］。且ROS 對上皮細胞的影響增加了大腸桿菌的體外細菌移位速率，調(diào)節(jié)了對細菌刺激的反應(yīng)并改變了刷狀緣糖基化，增加了細菌粘附，促進了細菌易位［5］。門靜脈高壓導(dǎo)致的氧自由基代謝產(chǎn)物生成增加可改變腸屏障的功能完整性，進一步促進肝硬化大鼠中的細菌易位［21］。CHIVA M 等發(fā)現(xiàn)，在肝硬化大鼠中，回腸和盲腸黏膜氧化損傷可能有利于細菌易位［7］，ASSIMAKOPOULOS SF 等研究發(fā)現(xiàn)晚期肝病患者腸道氧化應(yīng)激顯著升高［21］，與研究結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)與對照組相比，CCl4誘導(dǎo)的肝硬化模型大鼠的SOD、CAT、GSH、T-AOC 及HO-1 顯著降低，MAD 顯著增加（P＜0.05）。實驗組與模型組相比，SOD、CAT、GSH、T-AOC及HO-1顯著增加，MAD顯著降低（P＜0.05）。提示OMT 治療后提升了腸道黏膜抗氧化能力。

有研究證實［22］，激活腸道Nrf2 蛋白能夠減輕腸道氧化應(yīng)激損傷。生物納米硒（Biogenic nanoselenium，BNS）能夠減輕除草劑誘導(dǎo)的小鼠腸道上皮屏障損傷，其通過激活腸道Nrf2 蛋白減少細胞凋亡、降低氧化應(yīng)激，并以劑量和時間依賴性方式改善細胞氧化還原狀態(tài)。然而，敲除小鼠Nrf2基因后，BNS保護小鼠腸道的作用消失。有文章總結(jié)激活腸道Nrf2蛋白轉(zhuǎn)位不僅能夠減輕腸道各種活性氧化對腸壁破壞，還能減輕腸道炎癥反應(yīng)，增加腸道緊密連接蛋白表達及調(diào)劑腸道免疫反應(yīng)［23］。由此可見，腸道Nrf2 蛋白對腸道有保護作用。在本次研究中，我們檢測細胞質(zhì)、細胞核Nrf2及p-Nrf2的表達情況發(fā)現(xiàn)，OMT 治療肝硬化大鼠能夠影響Nrf2 蛋白磷酸化并促進轉(zhuǎn)位至細胞核，增加磷酸化Nrf2 蛋白在細胞質(zhì)及細胞核的含量，并可能通過此通路增加相應(yīng)抗氧化酶的表達從而減輕抗氧化損傷。但本研究現(xiàn)有證據(jù)不能直接將OMT 與Nrf2的激活聯(lián)系起來，我們僅僅發(fā)現(xiàn)使用OMT 能夠?qū)rf/HO-1通路產(chǎn)生影響。需進一步探討OMT對Nrf2蛋白的直接影響。

總之，本研究可以得出以下結(jié)論：在CCl4誘導(dǎo)的肝硬化合并腸道屏障破壞大鼠中，OMT 治療能夠減輕腸道氧化應(yīng)激損傷，并且增加大鼠體重，修復(fù)破損黏膜；其對肝硬化腸道的保護作用機制可能與腸道Nrf2/HO-1信號通路激活有關(guān)。