張道英，孫湘婷，陳樹群，陶濟明，劉 海

（贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000）

近年來隨著中藥研究的進一步發(fā)展，無論是消費者、制藥公司、藥品研發(fā)人員，還是國家藥品監(jiān)督管理部門都對中藥質(zhì)量提出了更高的要求。目前大部分中藥是以單一成分的含量來評價產(chǎn)品的質(zhì)量，然而中藥所含成分比較復(fù)雜，僅以單一成分含量來評價中藥產(chǎn)品質(zhì)量不夠全面準(zhǔn)確。因此提出了多指標(biāo)質(zhì)量評價，但是傳統(tǒng)的多指標(biāo)質(zhì)量評價需要眾多中藥對照品，對照品稀缺且提取成本昂貴。2006 年一測多評法（quantitative analysis of multicomponents by single-maker，QAMS）［1］的提出成功解決了這個問題。

本文主要研究中藥材金沙藤，別名竹園荽、黑須草、牛斗茜等，它是海金沙科植物海金沙、小葉海金沙或曲軸海金沙的干燥地上部分［2］。在夏末秋初生長比較旺盛，該時間段為最佳采收期。金沙藤性涼，用途廣泛，取鮮品搗爛后外敷可以治療燙傷和黃蜂蟄傷，也可與滑石、蒲蓄、甘草梢聯(lián)合使用治療淋癥［3］。此外有文獻報道分別用金沙藤和海金沙做抗菌實驗、抗炎實驗以及鎮(zhèn)痛實驗，實驗結(jié)果證實二者均有抗菌、抗炎和鎮(zhèn)痛的作用［4］。金沙藤化學(xué)成分復(fù)雜，目前已經(jīng)分離鑒定的化學(xué)成分就有十多種［5］，其中分離出的異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素四種化合物，均屬于黃酮類化合物。異槲皮苷有著色、抗氧化的特性［6］，以其為原料可以合成食品添加劑；紫云英苷可作為純天然抗氧化劑［7］，抗炎作用極強，有開發(fā)為抗乳腺炎藥物的潛能［8］；槲皮素對多種癌細胞有抑制作用，能防癌抗癌［9］，同時對心臟也有保護作用；山奈素亦稱“莰非醇”，能促進細胞對玉米葡糖的消耗，抑制乳腺癌MCF7 細胞增殖，有開發(fā)為治療乳腺癌藥物的潛能。

隨著金沙藤被廣泛應(yīng)用于臨床，目前關(guān)于金沙藤藥材的化學(xué)成分、對機體的影響及其作用機制等方面的研究越來越多［10-13］，周艷林等［4］分離鑒定了金沙藤中的10種化學(xué)成分，并對其抗氧化活性進行了評價，建議對金沙藤藥材進行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究時選擇異槲皮苷作為對照品。因此，本實驗以異槲皮苷為對照品，通過一測多評法測定金沙藤中異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素四種成分的含量。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑異槲皮苷［北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號：2157-25-3（190711），純度HPLC≥98%］，紫云英苷［北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限 公 司，批 號：480-10-4（190514），純 度HPLC≥98%］，槲皮素［北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號：117-39-5（190715），純度HPLC≥98%］，山奈素［北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號：520-18-3（190710），純度HPLC≥98%］，甲醇（色譜純），甲酸（色譜純），甲醇（分析純），超純水（自制）。

金沙藤藥材分別在江西贛州、湖南長沙和四川宜賓三個產(chǎn)地購買，均由藥學(xué)院生藥學(xué)教研室李加林副教授鑒定為金沙藤正品。

1.2儀器高效液相色譜儀［島津LC-15C，島津LC-16C，島津儀器（蘇州）有限公司］，JP-100 超聲波清洗機（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司），B-260 恒溫水浴鍋（上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司），F(xiàn)A1104十萬分之一分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），12S-FS1400 中藥粉碎機（合肥榮事達小家電有限公司），Exceed-Ad-16艾柯實驗室超純水機（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司），藥典三號篩（浙江上虞市道墟張興紗篩廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法原理中藥成分雖然復(fù)雜，但是各有效成分間存在一定的比例關(guān)系，在進行多指標(biāo)質(zhì)量評價時，引入相對校正因子，通過測定其中一個代表性成分（價格低廉，容易提取，含量豐富）的含量，根據(jù)待測成分與代表性成分間的相對校正因子，計算待測成分的含量。

2.2 混合對照品溶液的制備分別在4 個25 mL的容量瓶中加入精密稱取的11.05 mg、7.01 mg、4.12 mg、5.21 mg 異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素對照品，用甲醇定容，搖勻，即得上述四種成分的對照品溶液。

精密吸取異槲皮苷對照品溶液0.5 mL、紫云英苷對照品溶液0.5 mL、槲皮素對照品溶液0.2 mL和山奈素對照品溶液0.1 mL，并將全部溶液置于同一樣品瓶中，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取適量金沙藤藥材（湖南長沙產(chǎn)），置于中藥粉碎機中，粉碎成細粉，過三號藥典篩，精密稱定1.003 2 g，置于干燥的圓底燒瓶中，加入50 mL 純甲醇，水浴回流2 h，放冷后過濾，收集續(xù)濾液，再過0.45 μm 的微孔濾膜，將濾液置于樣品瓶中，貼好標(biāo)簽，備用。

2.4 色譜條件儀器：LC-15C 型高效液相色譜儀［島津儀器（蘇州）有限公司］；色譜柱：Agilent C18柱（規(guī)格150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；流動相：甲醇-0.3%甲酸，梯度洗脫，洗脫程序見表1，進樣量：10 μL。（色譜圖見圖1，圖2）。

表1 最佳的梯度洗脫程序

圖1 混合對照品溶液的HPLC圖

圖2 金沙藤樣品溶液的HPLC圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察精密吸取混合對照品溶液，按“2.4”項的色譜條件連續(xù)進樣6次，每次進樣10 μL，記錄峰面積，計算6 次進樣后4 種成分異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素、山奈素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值，4 種成分 的RSD 值分 別 為：2.71%、1.03%、1.44%、2.50%，表明儀器有良好的精密度。

2.5.2 重復(fù)性考察精密稱取6 份同一批次的金沙藤粉末，每份約1.0 g，制備成6 份供試品溶液，按“2.4”項的色譜條件依次進樣分析，根據(jù)色譜圖中各成分的峰面積計算金沙藤中四種成分的含量以及RSD 值，四種成分的RSD 值分別為：1.28%、1.41%、3.27%、2.65%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察精密稱取1.000 3 g 金沙藤粉末（湖南長沙產(chǎn)），制備成供試品溶液，按“2.4”項的色譜條件，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 進樣，記錄每次進樣四種成分的峰面積，然后計算四種成分峰面積的RSD 值，RSD 值分別為1.13%、1.07%、1.99%、1.04%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.4 線性關(guān)系考察精密量取5 份混合對照品溶液，每份1 mL，將它們依次稀釋1 倍、2 倍、3 倍、4倍、5 倍，將稀釋好的溶液分別標(biāo)記為1-1、1-2、1-3、1-4、1-5，按“2.4”項的色譜條件進樣分析，每個濃度的溶液進樣2次，每次進樣10 μL，記錄峰面積，取平均值。然后以峰面積為Y軸，進樣量（μg）為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程，見表2。表明四種成分的線性關(guān)系均良好。

表2 金沙藤中四種成分的線性關(guān)系

2.5.5 加樣回收率實驗精密稱取5 份湖南長沙產(chǎn)的金沙藤粉末（1.000 2 g、1.001 3 g、1.000 2 g、1.000 3 g、1.000 1 g），加入與金沙藤粉末中四種成分等量的異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素對照品溶液，制備成供試品溶液，按“2.4”項的色譜條件依次進樣10 μL，測定藥材中四種成分的含量，計算回收率，結(jié)果見表3，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表3 金沙藤中4種成分的加樣回收率實驗結(jié)果

2.6 相對校正因子的計算結(jié)合線性關(guān)系考察時配制的5種不同濃度對照品溶液進樣分析后所得色譜圖，根據(jù)公式fsi＝fs/fi=（AS/wS）/（Ai/wi），分別計算異槲皮苷（簡寫s）和紫云英苷（簡寫z）、槲皮素（簡寫h）、山奈素（簡寫n）之間的相對校正因子fsi［14］（其中AS為異槲皮苷對照品峰面積，wS為異槲皮苷對照品的質(zhì)量，Ai為某待測成分對照品峰面積，wi為某待測成分對照品的質(zhì)量）。計算結(jié)果見表4。

表4 金沙藤中四種成分間相對校正因子的計算結(jié)果

2.7 相對校正因子的重現(xiàn)性考察

2.7.1 不同儀器對相對校正因子的影響考察島津LC-15C、島津LC-16C 兩種儀器對相對校正因子的影響。取混合對照品溶液，使用上述兩種儀器，各進樣3次，記錄四種成分的峰面積，計算相對校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其相對校正因子的RSD 值，RSD 值分別為0.75%、3.14%、1.38%，表明不同儀器不會對相對校正因子產(chǎn)生顯著影響。

2.7.2 不同色譜柱對相對校正因子的影響考察Agilent C18、Shimadzu C18、Waters C18三種色譜柱對相對校正因子的影響。取混合對照品溶液，分別使用上述三種色譜柱進樣分析，記錄四種成分的峰面積，計算相對校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其校正因子的RSD 值，RSD 值分別為2.72%、0.71%、2.56%，表明不同色譜柱不會對相對校正因子產(chǎn)生顯著影響。

2.7.3 不同柱溫對相對校正因子的影響考察25 ℃、30 ℃、40 ℃三種柱溫對相對校正因子的影響，取混合對照品溶液，分別按上述三種溫度設(shè)置柱溫，每種柱溫條件下進樣3次，記錄四種成分的峰面積，計算相對校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其相對校正因子的RSD 值，RSD 值分別為3.60%、1.74%、2.66%，表明不同柱溫不會對相對校正因子產(chǎn)生顯著影響。

2.7.4 不同流速對相對校正因子的影響考察0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1三種流速對相對校正因子的影響，取混合對照品溶液，分別按上述三種設(shè)置流速，每種流速條件下進樣3次，記錄四種成分的峰面積，計算相對校正因子fs/z、fs/h、fs/n及其相對校正因子的RSD 值，RSD 值分別為0.79%、1.07%、1.04%，表明不同流速不會對相對校正因子產(chǎn)生顯著影響。

2.8 待測成分色譜峰的定位在考察了不同儀器（島津LC-15C、島津LC-16C）、不同柱溫（25 ℃、30 ℃、40 ℃）及不同流速（0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1）對相對校正因子的影響，與此同時也記錄了不同儀器、不同柱溫及不同流速條件下待測組分與內(nèi)參物的保留時間，內(nèi)參物保留時間已知，根據(jù)待測組分與內(nèi)參物的相對保留時間確定色譜峰的準(zhǔn)確峰位置，見表5。

表5 待測組分與內(nèi)參物相對保留時間

2.9 外標(biāo)法與一測多評法測定結(jié)果的比較精密稱取4 份金沙藤粉末（贛州贛江1.003 1 g、宜賓1.003 2 g、贛州李記1.002 5 g、長沙1.002 5 g），分別制備供試品溶液，按“2.4”項的色譜條件進樣10 μL，記錄四種成分峰面積。首先用外標(biāo)法測定金沙藤中異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈素的含量，然后再用一測多評法進行計算，結(jié)果見表6。為了驗證一測多評法的準(zhǔn)確性，將兩種測定方法得到的結(jié)果用Pearson相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果兩種方法之間的r為0.999 99，大于0.999 9，說明兩種方法相關(guān)性很高，再對兩種測定方法得到的結(jié)果進行t檢驗，P＞0.05，表明兩組測定結(jié)果無顯著性差異。

表6 一測多評法和外標(biāo)法測定金沙藤中四種成分的含量/%

3 討 論

3.1 從檢驗結(jié)果看，不論是用一測多評法還是用外標(biāo)法測定金沙藤中四種有效成分的含量，結(jié)果并無顯著性差異。表明“2.6”中計算得到相對校正因子可靠，在沒有紫云英苷、槲皮素和山奈素對照品的情況下，利用異槲皮苷對照品以及相對校正因子可計算得到金沙藤藥材中紫云英苷、槲皮素和山奈素的含量。

3.2 色譜峰的定位是否準(zhǔn)確決定了實驗的成敗，根據(jù)相對保留時間或保留時間差值確定色譜峰的準(zhǔn)確位置，是目前比較常用的方法，本實驗根據(jù)四種成分之間的相對保留時間定位待測成分的色譜峰。3.3 一測多評法整合了內(nèi)標(biāo)、外標(biāo)、校正因子等方法的優(yōu)勢，被越來越多地運用于中藥質(zhì)量評價和質(zhì)量控制中。它彌補了單一指標(biāo)質(zhì)量評價和多指標(biāo)質(zhì)量評價的不足，但在一測多評法方法學(xué)的建立過程中，還有許多問題值得進一步探究。