陳玲霞，周子涵，宋 濤，謝 璐，陳水親，劉志平，3

（1. 贛南醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院；2. 贛南醫(yī)學院2015級生物技術(shù)本科生；3. 贛南醫(yī)學院炎癥與免疫中心，江西 贛州 341000）

燙傷是最常見的皮膚損傷之一，在低收入國家燙傷致死率尤其高。它是臨床常見熱力燒傷的一種，是因熱力、熾熱金屬、火焰、蒸氣和高溫氣體等所致的體表組織損害，主要是皮膚損害，以中小面積Ⅱ度燙傷為主［1］。臨床表現(xiàn)主要為紅、腫、熱、痛，損傷主要發(fā)生在皮膚、黏膜，治療效果主要與病變范圍和深度有關(guān)。長期以來，沒有找到較為理想的治療藥物和方法，始終難以解決患者的疼痛、感染、結(jié)痂、留疤、植皮、致殘等問題［2］。因此，尋找新的有效且不良反應(yīng)小的藥物或輔助用藥成為當今研究熱點。

油茶（Camellia oleifera）為我國特有的油料樹種且資源豐富。茶油作為食用油無不良反應(yīng)，被稱為“東方的橄欖油”［3］，另外，茶油也一直用來治療皮膚燒燙傷及紅腫、發(fā)熱、瘙癢等［4］。油茶籽經(jīng)過壓榨可獲得茶枯餅，而茶枯餅提取物（Camellia cake extracts，CCEs）具有較高的應(yīng)用價值。有研究表明茶枯餅中含量最豐富的化合物是茶皂素和多酚類化合物［5-6］，茶皂素又具有抗炎抑菌、抗氧化性、抗腫瘤、降血脂、美白等功效［7-10］。來源于茶枯餅的油茶皂苷具有保護心肌、抗腫瘤等作用［11-13］，在抗炎方面可能通過降低血清和血管壁細胞黏附分子（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達來抑制燙傷導致的炎癥［14］，YE Y 等研究發(fā)現(xiàn)油茶皂苷可能通過抑制促炎癥細胞因子的產(chǎn)生從而控制小鼠皮膚炎癥［15］。最近，我們的研究發(fā)現(xiàn)CCEs 具有通過抑制炎癥細胞因子的表達和促進膠原蛋白的合成治療小鼠燙傷，并且CCEs 對人體沒有毒性［16］。這些研究提示CCEs 有抗皮膚炎癥的作用，本文利用CCEs為原材料制備不同濃度的燙傷膏，研究其對小鼠燙傷創(chuàng)面的治療作用，以期找到對燙傷創(chuàng)面愈合最佳的純天然燙傷膏。

1 材料和方法

1.1 小鼠的來源C57BL/6 小鼠購于南京模式動物研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 燙傷膏處方組成CCEs 由贛南醫(yī)學院藥學院李洪亮課題組提供，CCEs 的來源及分析已在之前發(fā)表論文中詳細描述［16］。我們將CCEs 的干粉溶解在30%甲醇中，并稀釋至合適的濃度。使用Agilent 1290 UHPLC 串 聯(lián)6230 ESI-TOF MS 系 統(tǒng)（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美國）進行CCEs提取混合物的分析，其代表性成分包括山茶苷A和B等。我們利用CCEs為原材料制備了5種燙傷膏（表1），具體成分如下：

表1 燙傷膏的種類及其配比

油脂型：凡士林（8009-03-8，西安天正藥輔有限公司）40 g，蜂蠟（B9340，Solarbio）18 g，液體石蠟（8012-95-1，西安天正藥輔有限公司）42 g，CCEs 50 mg。

水溶型：CCEs 1 g或2 g，PEG400（P8530，Solarbio）30.3 g，PEG4000（P8240，Solarbio）60.5 g，丙 二 醇（P7071，Solarbio）5 g，焦亞硫酸鈉（CB04927309，成都華邑藥用輔料制造有限責任公司）0.2 g，蒸餾水2 g，約制成100 g軟膏。

O/W 型：硬脂酸（SS8520，Solarbio）6 g，硬脂醇（8005-44-5，西安天正藥輔有限公司）6 g，凡士林6 g，液體石蠟9 g，司盤80（1338-43-8，陜西正一藥用輔料有限公司）1.6 g，吐溫80（9005-65-6，陜西正一藥用輔料有限公司）4.4 g，甘油（G8190，Solarbio）10 g，羥苯乙酯（120-47-8，陜西正一藥用輔料有限公司）0.2 g，CCEs 50 mg，丙二醇5 g，蒸餾水加至100 g。

W/O型：單硬脂酸甘油酯（30233-64-8，陜西正一藥用輔料有限公司）12 g，蜂蠟5 g，凡士林5 g，液體石蠟30 g，司盤80 2 g，吐溫80 1 g，羥苯乙酯0.2 g，CCEs 50 mg，丙二醇5 g，加蒸餾水至100 g。

1.2.2 燙傷模型的制備及分組取C57BL/6小鼠，體重18～20 g，用10%硫化鈉脫毛，隨機分為空白對照組、燙傷不處理組、燙傷后燙傷膏處理組、燙傷后尿素軟膏處理組。將小鼠放在控制板上，俯臥位顯示30%體表總面積。隨后，用1.5 cm 空心塑料管垂直放置在小鼠的背部。一端與皮膚接觸、從另一端倒入2 mL 100 ℃水浸泡25 s。造成深Ⅱ度燙傷（經(jīng)病理切片證實）。

分組給藥，燙傷后的小鼠單籠飼養(yǎng)，創(chuàng)面每2天換藥1 次，共14 d。生理鹽水沖洗后，各組外敷相應(yīng)的燙傷膏，給藥部位用無菌紗布縫扎固定。

1.3 觀察項目

1.3.1 創(chuàng)面愈合率燙傷后第14 d 用透明硫酸紙描記創(chuàng)面，以此為模板，將質(zhì)地均勻的硬紙板剪成同樣大小，然后用電子天平稱定重量，以重量代替面積，計算創(chuàng)傷愈合率。創(chuàng)傷愈合率=（原始燙傷面積－各時間點未愈合面積）/原始燙傷面積。

1.3.2 病理組織學觀察燙傷后14 d 切取創(chuàng)面外緣皮膚，經(jīng)福爾馬林固定后，石蠟切片，進行HE 染色及膠原蛋白染色（索萊寶Masson 三色染色試劑盒）。

1.4 統(tǒng)計學方法統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 8 軟件。所有計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 燙傷膏的選擇為了選擇最佳燙傷膏，我們對已經(jīng)構(gòu)建好的燙傷模型進行藥物治療。共8 組，空白對照、燙傷不處理組、燙傷后尿素軟膏處理組和燙傷后5種自制燙傷膏處理組。預(yù)實驗結(jié)果顯示燙傷不處理小鼠在第14 d 燙傷皮膚處開始出現(xiàn)增生肉芽組織，而尿素軟膏、1#燙傷膏和2#燙傷膏治療效果較好（圖1）。后期我們選擇1#燙傷膏和2#燙傷膏進行藥膏治療效果的評估。

圖1 燙傷膏的治療效果

2.2 各組創(chuàng)面愈合率的比較為了進一步研究1#和2#燙傷膏對燙傷的治療效果，我們對燙傷不處理組、燙傷后尿素軟膏處理組、燙傷后1#燙傷膏處理組和燙傷后2#燙傷膏處理組的創(chuàng)面愈合率進行計算。結(jié)果顯示與燙傷不處理組相比，1#燙傷膏處理組的創(chuàng)面愈合率是0.91（F=5.3，P=0.009）；尿素軟膏涂抹組的創(chuàng)面愈合率是0.87（F=5.3，P=0.039），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；2#燙傷膏處理組的創(chuàng)面愈合率（0.74）比燙傷不處理組（0.68）高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2）。由于2#燙傷膏治療燙傷的效果不顯著，我們選擇1#燙傷膏進行下一步研究。

圖2 各組創(chuàng)傷愈合率比較

2.3 各組燙傷部位病理學觀察為了研究油茶燙傷膏對小鼠燙傷的治療作用機制，我們對小鼠燙傷部位分別使用1#燙傷膏、尿素軟膏進行涂抹，對照小鼠含空白對照組和燙傷不處理組，第14 d 收集燙傷皮膚組織進行HE 染色和膠原蛋白染色。結(jié)果顯示空白對照組各層結(jié)構(gòu)完整，表皮層扁平整齊，毛囊和皮脂腺分布均勻；真皮中的膠原纖維束呈螺旋狀，束間縱向排列整齊；真皮層組織及附屬結(jié)構(gòu)清晰可辨，細胞形態(tài)飽滿；燙傷不處理組小鼠皮膚燙傷創(chuàng)面可見許多脫落的表皮細胞，細胞結(jié)構(gòu)變形壞死，表皮層凹凸不平有縱向溝痕，真皮層與表皮界限不明，真皮層多數(shù)顯空洞，細胞無序排列，膠原纖維束少且薄，排列無序，有些顯斷裂或點狀；尿素軟膏組小鼠皮膚表皮仍可見空隙或裂痕狀，真皮層增厚，與燙傷不處理組相比，細胞形態(tài)要明顯好轉(zhuǎn)，真皮內(nèi)膠原纖維束增厚，且排列整齊；1#燙傷膏組小鼠皮膚真皮層與表皮界限分明，毛囊、皮脂腺結(jié)構(gòu)清晰可見，細胞形態(tài)恢復(fù)良好，膠原纖維束增厚明顯，恢復(fù)接近正常水平（圖3）。

圖3 各組燙傷部位病理組織學觀察

3 討 論

燙傷在人群中的發(fā)病率約0.2%，且兒童患者超過1/3，損傷輕微則治愈率較高，但若損傷嚴重死亡率較高［17］。因此，如何有效地提高燒燙傷患者的創(chuàng)面愈合并降低死亡率仍是我們急需解決的問題。本文通過對不同類型燙傷膏的治療效果比較，初期選擇出燙傷愈合效果最好的水溶型軟膏1#和2#用于后期的治療效果檢測，而水溶型軟膏1#和2#的治愈效果良好可能跟燙傷膏的類型有關(guān)。油脂型燙傷膏中CCEs 溶解不充分且釋藥慢；W/O 或O/W 型乳膏劑不適用于有大量組織液滲出的創(chuàng)面，使用時會導致分泌物重新透入皮膚而使得創(chuàng)口惡化［18］。燒燙傷常導致皮膚屏障被破壞，大量組織液滲出、出血、創(chuàng)面糜爛［19］，而水溶型燙傷膏釋藥快且易洗除，能夠吸收組織分泌液，非常適用于燒燙傷的治療，但對皮膚的潤滑、軟化作用較差，后期可對該燙傷膏添加防腐劑和保濕劑進行優(yōu)化。

實驗動物燒燙傷模型相關(guān)的研究報道較多，如豬［20］、兔［21］、大鼠［22］、小鼠［23］的燙傷模型研究，建模所用的對象和方法多樣，尚缺乏標準化的燙傷動物模型。目前采用的熱水燙傷、蒸汽燙傷等方法常導致皮膚創(chuàng)面邊緣不齊，燙傷面積和深度不易控制，重復(fù)性差［24］。本文采取熱水燙傷建立了深Ⅱ燙傷模型，通過吸管引流，改善燙傷產(chǎn)生的一致性，減少組間差異，重復(fù)性較好。本實驗通過對創(chuàng)傷愈合率的計算、燙傷部位HE 染色和膠原蛋白染色，評估自制燙傷膏對燙傷創(chuàng)面的治療效果。燙傷不處理組小鼠表現(xiàn)為皮膚組織出現(xiàn)細胞結(jié)構(gòu)變形壞死、膠原蛋白減少且嚴重被破壞等，而自制燙傷膏和尿素軟膏的使用減輕了這些損傷。膠原蛋白是皮膚的主要組成成份，對皮膚損傷的恢復(fù)至關(guān)重要［25-26］，自制燙傷膏的使用逆轉(zhuǎn)了膠原蛋白的減少，提示皮膚從損傷中恢復(fù)。而且燙傷膏的使用，促使了膠原蛋白的增生，與空白對照組相比，膠原纖維束更厚，可能是燙傷膏促使皮膚恢復(fù)的原因。燙傷膏可以促使膠原蛋白增生，可能是茶枯餅提取物的作用效果，但茶枯餅提取物的成分多，具體治療燙傷的分子尚待研究。有研究表明茶枯餅提取物具有美白功效［27］，后期可用于美容產(chǎn)品的開發(fā)與利用。

燙傷后愈合過程，主要包括急性期炎性反應(yīng)和組織修復(fù)細胞的作用［28］，它涉及炎癥反應(yīng)、細胞增殖、燙傷創(chuàng)面收縮、瘢痕形成及組織重塑等［29］。從皮膚組織病理學、膠原蛋白的形態(tài)和創(chuàng)面愈合率來看，自制燙傷膏不僅能有效地促進創(chuàng)面愈合，改善創(chuàng)面病理組織細胞結(jié)構(gòu)，而且能有效地促進創(chuàng)面組織中膠原蛋白的合成和增加，促進創(chuàng)面組織的修復(fù)。燙傷膏改善創(chuàng)面愈合和促進創(chuàng)面修復(fù)的作用，可能與抑制炎性細胞因子、增加皮膚相關(guān)生長因子和細胞外基質(zhì)表達的作用機制有關(guān)［30-31］。無論是抑制炎癥、抑制細菌感染或者促進愈合修復(fù)等都還需更深入的研究，以開發(fā)出真正的純天然燙傷膏用于皮膚損傷。