朱惠芳，鐘小明，賴珊瑩，陳章宇，廖紅群，羅開源，3

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心新生兒科；2. 贛南醫(yī)學(xué)院2018級碩士研究生；3. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心兒內(nèi)科，江西 贛州 341000）

新生兒缺氧缺血性腦?。℉ypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是常見的一種新生兒疾病，主要由圍產(chǎn)期窒息引起的腦組織部分或完全缺氧、腦供血流減少或中斷導(dǎo)致胎兒或新生兒的腦損害，嚴(yán)重情況下可直接造成患兒死亡，重度HIE 死亡率高達(dá)35%［1-2］。存活的新生兒中，嚴(yán)重缺氧的占0.2%～1%，常伴有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)損害，后遺神經(jīng)缺陷達(dá)20%～30%［3］。其發(fā)病原因比較復(fù)雜，致病機(jī)制尚未完全明確，可能與缺氧缺血后繼發(fā)神經(jīng)細(xì)胞代謝障礙、線粒體損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致大量氧自由基產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞死亡等相關(guān)［4-5］。目前對HIE 尚無成熟有效的治療方法。因此，明確其致病機(jī)制，是尋找治療HIE策略的有效途徑。

HIE 最主要的病理生理機(jī)制是大腦組織缺氧，而氧氣是保證細(xì)胞進(jìn)行新陳代謝，包括能量代謝和物質(zhì)代謝的基本要素，它們是機(jī)體維持生命活動的基礎(chǔ)。因此，大腦組織細(xì)胞經(jīng)歷缺氧合并缺血，使新陳代謝中斷，最終影響神經(jīng)細(xì)胞的活性，導(dǎo)致死亡，神經(jīng)細(xì)胞死亡是腦損傷的最直接后果［6-8］。細(xì)胞死亡方式主要包括壞死、自噬和凋亡。通常情況下，凋亡引起的細(xì)胞死亡，稱為Ⅰ型死亡；自噬可通過加快細(xì)胞的代謝并協(xié)助細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境，以達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞存活的目的，但“吃”了細(xì)胞內(nèi)大部分細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)的自噬也會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，稱為Ⅱ型死亡。在缺氧缺血條件下，早期細(xì)胞凋亡信號通路可通過Caspase 依賴和不依賴的途徑被激活，主要發(fā)生在線粒體上［9］。Caspase 是半胱氨酸蛋白水解酶，既可作為細(xì)胞凋亡途徑的起始因子，如Caspases-8和Caspases-9；又可作為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，如Caspase-3。此外，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，如B淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-Associated X，Bax）表達(dá)水平的改變，也參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。自噬主要發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與細(xì)胞凋亡通路之間存在部分交叉調(diào)控，兩者之間存在相互制約的關(guān)系［10］。但由于自噬的最終結(jié)局既可能介導(dǎo)細(xì)胞的存活，也可能導(dǎo)致細(xì)胞的死亡［11-12］，因此，明確細(xì)胞自噬在神經(jīng)損害過程中的作用，是闡明HIE過程中神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵。

磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）是一條保守的信號通路，可參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。此外，PI3K 信號通路同樣參與某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，比如，腦缺氧缺血再灌注導(dǎo)致的腦損傷［13］。在接受細(xì)胞內(nèi)外的刺激以后，PI3K 信號通路被激活，絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B（Protein Kinase B，PKB），又被稱為AKT，發(fā)生磷酸化并被激活。活化的AKT 可通過多種途徑對下游的信號分子及靶蛋白進(jìn)行磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡的作用［14］。近年來的研究表明，孕酮（Progesterone，PG）可減輕缺氧缺血性腦損傷，營養(yǎng)和保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)等［15-16］。缺血缺氧主要損傷大腦皮層、海馬以及大腦室下區(qū)神經(jīng)元。海馬及海馬環(huán)路作為大腦古皮質(zhì)，是哺乳類動物大腦皮質(zhì)中被研究得最詳細(xì)的一個部位，在空間記憶力、學(xué)習(xí)能力以及情感調(diào)控中發(fā)揮重要作用。為探討孕酮對缺氧缺血性腦損傷過程中海馬神經(jīng)細(xì)胞的死亡的影響，本研究采用改良的RICE 法制備新生大鼠缺氧缺血腦損傷模型［17］，觀察模型動物大腦損傷側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元發(fā)生凋亡和自噬的情況，并檢測AKT 信號通路在腦損傷過程中是否激活，以期為臨床治療新生兒HIE提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料孕酮購買于Sigma-Aldrich。兔抗大鼠AKT多克隆抗體、兔抗大鼠磷酸化AKT-S473多克隆抗體、兔抗大鼠LC3多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體、兔抗大鼠Bcl-2 多克隆、兔抗大鼠Bax多克隆抗體、兔抗大鼠Beclin-1 多克隆抗體、兔抗大鼠p62 多克隆抗體和兔抗大鼠GAPDH 多克隆抗體均購買于北京Proteintech 公司。Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和Tunel 試劑盒均購買于碧云天公司。Neurobasal-A 培養(yǎng)基購買于Gibco 公司。B-27和L-谷氨酰胺購買于Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組40只7日齡清潔級SD 大鼠由贛南醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重為（17.2±0.5）g，雌雄不限。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22 ℃～24 ℃，濕度為40%～50%。隨機(jī)分為4 組，每組10 只：假手術(shù)組（Sham）、模型溶劑對照組（HIBD＋Vehicle）、模型孕酮低劑量組（HIBD＋PG 5 mg·kg-1）和模型孕酮高劑量組（HIBD＋PG 10 mg·kg-1）。

1.2.2 動物模型建立本文根據(jù)RICE 法并結(jié)合改良方法進(jìn)行缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）模型構(gòu)建［17］。本動物實(shí)驗(yàn)所有操作獲得贛南醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。SD 新生大鼠腹腔注射溶劑對照或孕酮（5 mg·kg-1，10 mg·kg-1）1 h 后，乙醚吸入麻醉。假手術(shù)組動物僅對左側(cè)頸總動脈做剝離處理，不做缺血和缺氧處理；模型組對左側(cè)頸總動脈進(jìn)行分離并結(jié)扎。每只動物手術(shù)時間控制在5～10 min。手術(shù)結(jié)束后，將新生大鼠放回母鼠身邊休息1.5 h。然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，以1.5 L·min-1的流速持續(xù)通入濕化的8%O2+92%N2的混合氣體，缺氧處理1 h 后，放回母鼠身邊。24 h以后，頸椎脫臼處死大鼠，取大鼠的海馬組織進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2.3 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)剝離未經(jīng)任何處理的7 日齡SD 大鼠海馬組織，置于4°C 預(yù)冷的DMEM高糖培養(yǎng)基中，剪刀剪碎后，加入2 mg·mL-1木瓜蛋白酶和0.1 mg·mL-1的DNA 消化酶，37 °C 消化30 min后，加入1 mL的胎牛血清終止反應(yīng)。經(jīng)離心并計(jì)數(shù)后，取1×106的細(xì)胞接種至經(jīng)多聚賴氨酸包被的6孔板中，無血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h 后，將未貼壁的細(xì)胞吸掉，并清洗一次，加入Neurobasal-A培養(yǎng)基，添加2%的B-27 以及2 mmol·L-1L-谷氨酰胺，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 糖-氧剝奪實(shí)驗(yàn)原代海馬神經(jīng)元貼壁后，細(xì)胞密度約80%更換無糖無血清的MEM 培養(yǎng)基。置于經(jīng)氮?dú)庀♂尩?%O2培養(yǎng)箱中進(jìn)行糖-氧剝奪處理。1 h 后，細(xì)胞培養(yǎng)基更換成Neurobasal-A，添加2%的B-27 以及2 mmol·L-1L-谷氨酰胺，繼續(xù)置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.5 免疫印跡假手術(shù)組與模型組大鼠的海馬組織取材后，稱重，剪刀剪碎，加入RIPA裂解液，超聲裂解組織至清亮后，離心，測定蛋白濃度。SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后孵育特異性一抗二抗，經(jīng)ECL顯色后在ImageQuant LAS 4000 mini儀器曝光。

1.2.6 免疫組化取假手術(shù)組與模型組大鼠的大腦組織，經(jīng)10%多聚甲醛固定過夜后，脫水、石蠟包被、切片（5 μm），按免疫組化的常規(guī)操作對石蠟片進(jìn)行脫蠟和復(fù)水。然后按照Tunel 凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，大腦組織經(jīng)DAB 染色后在普通顯微鏡下（Nikon ECLIPSE Ti）觀察和拍照。

1.2.7 細(xì)胞凋亡大鼠海馬神經(jīng)元分離培養(yǎng)后，取50 nmol·L-1孕酮或等量體積的溶劑預(yù)處理細(xì)胞。然后對細(xì)胞進(jìn)行糖-氧剝奪1 h。12 h 后收集海馬神經(jīng)元，按照Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用流式細(xì)胞儀檢測凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 分析數(shù)據(jù)和GraphPad Prism Software 4.0 作圖比較處理，數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 孕酮抑制HIBD 模型大鼠的AKT 活性如圖1A所示，7日齡新生大鼠5 mg·kg-1或10 mg·kg-1孕酮預(yù)處理1 h 后，結(jié)扎左側(cè)頸總動脈（圖1B）制備缺血模型。將新生大鼠置于8%O2＋92%N2通氣的密閉培養(yǎng)倉中，進(jìn)行缺氧處理1 h，各組大鼠的體重?zé)o顯著性差異（圖1C）。24 h 后，取大鼠左側(cè)腦的海馬神經(jīng)組織，進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果顯示孕酮可劑量依賴性抑制磷酸化AKT的水平（圖1D，1E）。

圖1 孕酮抑制HIBD新生大鼠海馬神經(jīng)元AKT的激活

2.2 孕酮抑制神經(jīng)元凋亡如圖2A 所示，假手術(shù)組新生大鼠的神經(jīng)元發(fā)生凋亡的數(shù)目非常少，而在模型組中，大量的神經(jīng)元凋亡和死亡，孕酮的預(yù)處理可劑量依賴性抑制缺血缺氧造成的神經(jīng)元死亡。免疫印跡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在模型組中，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)水平顯著下降，而促凋亡蛋白Bax 的水平上升。此外，細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行蛋白Caspase-3的活化型水平也明顯升高（圖2B，2C）。孕酮處理后Bcl-2、活化型Caspase-3 蛋白表達(dá)降低，Bax 蛋白表達(dá)增加。

圖2 孕酮抑制海馬神經(jīng)元凋亡

2.3 孕酮抑制海馬神經(jīng)元自噬在模型組中，LC3-Ⅱ表達(dá)增加，而孕酮處理后，LC3-Ⅱ表達(dá)降低。與假手術(shù)組相比，模型組Beclin-1 的表達(dá)增加，可溶性p62 蛋白表達(dá)降低；孕酮處理后，Beclin-1 表達(dá)降低，可溶性p62蛋白表達(dá)增加（圖3A，3B）。

圖3 孕酮抑制海馬神經(jīng)元自噬

2.4 孕酮通過AKT 信號通路抑制海馬神經(jīng)元凋亡如圖4A 所示，OGD 處理以后，神經(jīng)元的形態(tài)和發(fā)生細(xì)胞凋亡的數(shù)量都發(fā)生了顯著改變。而孕酮處理后，可部分抑制OGD 所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。孕酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖4B所示。經(jīng)免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，OGD處理的神經(jīng)元促凋亡相關(guān)蛋白Bax以及活化型Caspase-3 的水平升高，而孕酮處理后，AKT 的活性被抑制，Bax 以及活化型Caspase-3 的水平也明顯降低（圖4C-4F）。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，孕酮可抑制OGD 誘導(dǎo)的早、晚期細(xì)胞凋亡的發(fā)生（圖4G，4H）。

圖4 孕酮通過AKT信號通路抑制海馬神經(jīng)元凋亡

3 討 論

新生兒缺氧缺血性腦病主要是圍生期窒息造成的腦部損害，這種損傷對中樞神經(jīng)系統(tǒng)帶來的影響可能是永久性的，甚至造成死亡。一般來說，神經(jīng)元的死亡是導(dǎo)致神經(jīng)損傷的最主要的病理原因。因此，充分認(rèn)識神經(jīng)元死亡的機(jī)制，是研究和開發(fā)缺氧缺血性腦病治療策略的關(guān)鍵。從生理角度來看，大鼠腦部供血方式與人類相似，都是頸內(nèi)動脈和椎動脈在大腦底部形成Willis 環(huán)；從發(fā)育角度看，7 日齡大鼠與人類的新生兒（≤28 天）發(fā)育水平是相當(dāng)?shù)?。僅結(jié)扎一側(cè)頸動脈不能建立理想的缺氧缺血模型，只有在結(jié)扎動脈基礎(chǔ)上同時給予缺氧處理才能在結(jié)扎動脈側(cè)大腦形成缺血缺氧性腦損傷（Hypoxicischemic brain damage，HIBD）的病變，使用該模型研究新生兒HIE疾病模型的價值已獲得肯定。本課題通過RICE 改良法構(gòu)建新生大鼠缺氧缺血模型，并在此基礎(chǔ)上研究孕酮對缺氧缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡的影響。流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，模型組動物海馬區(qū)的神經(jīng)元發(fā)生了明顯的凋亡，而孕酮的提前干預(yù)可顯著降低凋亡的細(xì)胞數(shù)。通過對自噬信號通路相關(guān)蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血新生大鼠的結(jié)扎動脈側(cè)大腦海馬組織同樣發(fā)生了自噬，而孕酮的處理可顯著降低自噬的水平。由此可見，在缺氧缺血性腦病發(fā)生的早期（24 h 內(nèi)），病變區(qū)域神經(jīng)元同時發(fā)生了凋亡和自噬，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了相應(yīng)的變化。對相關(guān)機(jī)制做進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AKT 信號通路在凋亡和自噬過程中是被激活的。而使用AKT 抑制劑處理原代海馬神經(jīng)元，可逆轉(zhuǎn)由糖-氧剝奪導(dǎo)致的凋亡和自噬，說明神經(jīng)元的凋亡和自噬一定程度上依賴于AKT信號通路。

作為天然的孕激素，孕酮在臨床上廣泛用于緩解更年期婦女的激素水平改變導(dǎo)致的疾病。而在動物疾病模型中，如阿爾茨海默病或中風(fēng)，孕酮可作為神經(jīng)營養(yǎng)因子，表現(xiàn)出良好的神經(jīng)保護(hù)作用［17-18］。而在HIBD 動物模型中，孕酮可抑制巨噬細(xì)胞從血液中滲透到大腦組織中，并減少炎癥因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1（Interleukin-1，IL-1）等的釋放［19-20］。從機(jī)制上來看，MAPK（ERK1/2）和PI3K/AKT 是涉及到孕酮的神經(jīng)保護(hù)作用的主要信號通路。我們的研究結(jié)果表明孕酮可作為治療HIBD、抑制凋亡和自噬引起的細(xì)胞死亡的潛在藥物。本研究存在不足是僅停留在動物試驗(yàn)上的模型研究，因此，為更好更全面地分析孕酮在臨床上的治療效果，還需要進(jìn)一步開展臨床研究。