于淼，李鐵成

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科，遼寧 錦州 121000)

冠狀動(dòng)脈再通技術(shù)的普及使心肌梗死患者的生存率大幅提升，但缺血心肌恢復(fù)灌注后所引發(fā)的額外損傷，即心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury， MI/RI)，又可導(dǎo)致先前存活的心肌組織損傷加重，降低患者的生存質(zhì)量[1]。MI/RI是多因素參與的復(fù)雜病理生理過(guò)程，多項(xiàng)研究證實(shí)，細(xì)胞調(diào)亡在此過(guò)程中扮演著重要的角色[2-4]。最新研究表明，轉(zhuǎn)錄因子p53可有效調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開(kāi)放，并可通過(guò)凋亡信號(hào)通路激活調(diào)控因子完成轉(zhuǎn)錄或直接在線粒體膜上與B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白相互作用而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5，6]，導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷。

半枝蓮總黃酮(Scutellariabarbataflavonoids，SBF)是從半枝蓮中提取的黃酮類化合物。研究表明，SBF具有抗腫瘤、抗病毒、解熱、保肝、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等多種功效，并可使神經(jīng)細(xì)胞的凋亡降低[7-9]，具有極大的研究及應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)探討SBF在MI/RI中的作用并分析其可能的作用機(jī)制，從而進(jìn)一步明確SBF的器官保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量(230±20)g，由錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑與設(shè)備

SBF(陜西森元生物科技有限公司，中國(guó))；氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT)(蘇州海恒生物醫(yī)藥有限公司，中國(guó))；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)檢測(cè)試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司，中國(guó))；Bcl-2、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗和二抗(上海博湖生物科技有限公司，中國(guó))；BCA(bicinchoninincacid)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，中國(guó))；p53蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)檢測(cè)試劑盒(北京盛科博源生物科技有限公司，中國(guó))；原位末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)檢測(cè)、核蛋白提取試劑盒(亞科因公司，中國(guó))。呼吸機(jī)DH-105、床邊監(jiān)護(hù)儀BSM-7105K(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠，中國(guó))；超聲波破碎儀VCX-130(美國(guó)Sonics公司，美國(guó))；生物顯微鏡DM500、切片機(jī)RM2235、烤片機(jī)KPJ-435(徠卡，德國(guó))；EnduroTMVE10垂直電泳系統(tǒng)(萊伯特公司，美國(guó))、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)FluorChem E(Alpha公司，美國(guó))；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)Ldz4-1.2(北京雷勒爾離心機(jī)有限公司，中國(guó))；其他由錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將50只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為5組，每組10只。(1)假手術(shù)組；(2)MI/RI組；(3)低劑量組(SBF 30 mg/kg)；(4)中劑量組(SBF 75 mg/kg)；(5)高劑量組(SBF 140 mg/kg)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前均用普通飼料及飲用水飼養(yǎng)，采用灌胃方式對(duì)低、中、高劑量組的30只大鼠給予對(duì)應(yīng)劑量的SBF，1次/d，連續(xù)1周。

1.4 MI/RI模型建立

術(shù)前禁食12 h，不禁水。20%烏拉坦(150 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，連接心電圖機(jī)，行氣管插管，連接呼吸機(jī)(潮氣量2 ml/100 g，頻率60次/min，吸呼比1∶3)。沿胸骨左緣3、4肋間，剪開(kāi)皮膚，鈍性分離肌肉組織，開(kāi)胸，暴露心包，剔除心包膜。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎處理，其余4組均在左冠狀動(dòng)脈前降支發(fā)出2 mm處，用5-0手術(shù)縫合線進(jìn)行結(jié)扎，立即可見(jiàn)心電圖ST段抬高，30 min后減掉結(jié)扎線，恢復(fù)血液灌注并維持再灌注60 min。再灌注后ST段回落50%即造模成功。

1.5 采集標(biāo)本

造模完成后，立刻從頸總動(dòng)脈取血并將心臟完整摘除。動(dòng)脈血放置室溫靜置30 min，離心(3 000轉(zhuǎn)/min，10 min)，將血清置于EP管內(nèi)，標(biāo)記后存放至-80℃冰箱保存?zhèn)溆么龣z。各組隨機(jī)選取5個(gè)心臟組織，將心臟分為兩部分，一部分固定于4%多聚甲醛溶液內(nèi)，4℃冰箱保存；另一部分置于-80℃冰箱內(nèi)待檢。各組中剩余的5個(gè)心臟組織，保留左心室，剔除其余組織，放置于-20℃冰箱中冷凍1 h待檢。

1.6 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

1.6.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定LDH和CK-MB 取離心后的血清，加樣，滴加對(duì)應(yīng)試劑，封板，37℃溫育30 min，洗板5次，添加顯色劑，避光孵育15 min，加入終止液，酶標(biāo)儀比色。

1.6.2 心肌梗死面積測(cè)定 將-20℃冰箱冷凍1 h后的心肌組織取出，沿心肌帶走形切成5個(gè)等厚的5 mm切片，0.5%NBT溶液37℃水浴浸染30 min。NBT染色后，暗紫色區(qū)域?yàn)檎Ｐ募。u紅色或灰白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ佬募?。測(cè)量心肌梗死面積采用Image-Pro Plus 6.0軟件。心肌梗死面積(%)=梗死部分面積/總心肌面積×100%。

1.6.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取出保存于-80℃冰箱內(nèi)的心肌組織，融化，剪碎，提取核蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白定量。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜。加入Bcl-2(1∶2 000)及β-actin(1∶5 000)一抗孵育，4℃過(guò)夜，加入羊抗兔IgG(1∶5 000)二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光成像。Image J軟件行條帶灰度值分析，計(jì)算目標(biāo)蛋白表達(dá)量。p53、Caspase-3抗體檢測(cè)同前。

1.6.4 TUNEL染色 將固定于4%多聚甲醛中的心肌組織行脫水、透明、包埋、切割，制成石蠟切片。行TUNEL染色，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗、暗濕盒孵育、洗滌、二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)避光顯色、蘇木素復(fù)染，光鏡下觀察，拍照。采用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/總細(xì)胞個(gè)數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組血清LDH、CK-MB的含量比較

與假手術(shù)組比較，MI/RI組、SBF各劑量組LDH和CK-MB含量均明顯增加(P<0.01)；與MI/RI組比較，SBF各劑量組LDH和CK-MB含量顯著下降(P<0.01)；與SBF低劑量組比較，中、高劑量組LDH、CK-MB含量顯著下降(P<0.01)；與SBF中劑量組比較，高劑量組LDH、CK-MB含量下降(P<0.01或P<0.05；表1)。

表1 各組LDH和CK-MB含量比較

2.2 各組心肌梗死的面積比較

假手術(shù)組均為暗紫色，無(wú)明顯梗死發(fā)生。與假手術(shù)組比較，MI/RI組心肌梗死面積顯著增加(0.80%和37.21%，P<0.01)；與MI/RI組比較，SBF各劑量組均有明顯紅染梗死灶，SBF低、中、高劑量組梗死面積呈劑量依賴性顯著下降(27.45%和16.08%和8.00%，P<0.01或P<0.05；圖1)。

圖1 各組心肌梗死的面積比較Figure 1 Comparison of myocardial infarction area between each group (n=5)A: NBT staining; B: quantitative analysis results. NBT: nitroblue tetrazolium; MI/RI: myocardial ischemia/reperfusion injury. Compared with sham group, #P<0.05, *P<0.01; compared with MI/RI group, △P<0.01; compared with low dose group, ▲P<0.01; compared with middle dose group, ☆P<0.01.

2.3 各組p53、Caspase-3、Bcl-2蛋白的表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，MI/RI組p53和Caspase-3表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，SBF各劑量組p53和Caspase-3表達(dá)升高(P<0.01或P<0.05)，Bcl-2表達(dá)下降(P<0.01)；與MI/RI組比較，SBF低、中、高劑量組p53和Caspase-3表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與SBF低劑量組比較，中劑量組p53、Caspase-3和Bcl-2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量組p53和Caspase-3表達(dá)明顯下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；與SBF中劑量組比較，高劑量組p53和Caspase-3表達(dá)大幅減低，Bcl-2表達(dá)大幅上升(P<0.01；圖2)。

圖2 各組p53、Caspase-3、Bcl-2蛋白的表達(dá)比較Figure 2 Comparison of p53, Caspase-3 and Bcl-2 proteins expression between each group (n=5)A: Western blot; B: quantitative analysis results. MI/RI: myocardial ischemia/reperfusion injury. Compared with sham group, #P<0.05, *P<0.01; compared with MI/RI group, △P<0.01; compared with low dose group, ▲P>0.05, ☆P<0.01; compared with middle dose group, ★P<0.01.

2.4 各組心肌細(xì)胞調(diào)亡比較

與假手術(shù)組比較，MI/RI組心肌細(xì)胞凋亡率明顯上升(15.10%和43.82%，P<0.01)，SBF各劑量組細(xì)胞凋亡率也顯著增加(P<0.01)；與MI/RI組比較，SBF低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性下降(35.91%、32.01%和22.67%，P<0.05，P<0.01；圖3，4)。

圖3 各組心肌細(xì)胞凋亡TUNEL染色結(jié)果Figure 3 TUNEL staining results of myocardial cell apoptosis between each groupTUNEL: terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling; MI/RI: myocardial ischemia/reperfusion injury.

圖4 各組心肌細(xì)胞調(diào)亡率比較Figure 4 Comparison of myocardial cell apoptosis rate between each group (n=5)TUNEL: terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling; MI/RI: myocardial ischemia/reperfusion injury. Compared with sham group, *P<0.01; compared with MI/RIgroup; #P<0.01; compared with low dose group, △P<0.05; compared with middle dose group, ▲P<0.01.

3 討 論

再灌注損傷時(shí)，多因素協(xié)同作用使蛋白酶活性變化，細(xì)胞膜的通透性升高，影響心肌細(xì)胞代謝的關(guān)鍵蛋白酶LDH和CK-MB從胞漿入血，使其在血清中的含量升高，故常作為敏感指標(biāo)反映心肌細(xì)胞受損程度[10,11]。同時(shí)，相關(guān)蛋白的表達(dá)也隨心肌損傷發(fā)生復(fù)雜變化，調(diào)控細(xì)胞凋亡。p53蛋白從內(nèi)源性途徑啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，激活Bcl-2家族蛋白，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)一步激活Caspase-3，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-15]。

SBF的主要成分為野黃芩苷，研究證實(shí)，在腫瘤治療及腦損傷保護(hù)中具有抑制細(xì)胞凋亡作用[16,17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SBF對(duì)心肌缺血/再灌注損傷具有一定的保護(hù)功效。LDH和CK-MB含量、梗死面積及細(xì)胞凋亡率均能顯著證實(shí)SBF的保護(hù)作用。與假手術(shù)組比較，MI/RI組p53和Caspase-3表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2下調(diào)，說(shuō)明在MI/RI時(shí)可能發(fā)生了由p53介導(dǎo)的Caspase-3凋亡途徑，誘導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞凋亡；相比于MI/RI組，SBF各劑量組p53、Caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)變化明顯，且高劑量組p53、Caspase-3和Bcl-2蛋白變化顯著，可能與SBF預(yù)處理抑制p53表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)。

綜上，半枝蓮的活血化瘀功效在心腦血管疾病治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但其有效化學(xué)成分復(fù)雜，目前的研究熱點(diǎn)依舊是有效成分的分析和提取。本實(shí)驗(yàn)表明，SBF可抑制由p53通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，產(chǎn)生心肌保護(hù)功效。同時(shí)，MI/RI發(fā)病機(jī)制較多，并且各通路間相互協(xié)同，目前對(duì)其具體保護(hù)機(jī)制尚不能明確。本實(shí)驗(yàn)僅從p53信號(hào)通路角度，探討SBF與MI/RI的關(guān)系，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步論證。