吳旭玲，董楝，彭爽，葉蘭，徐祖才，馮占輝

1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004；3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，貴州 遵義 563099

癲癇是大腦皮層神經(jīng)元異常放電所導(dǎo)致的以癇性發(fā)作為特點(diǎn)的臨床綜合征[1]。反復(fù)癇性發(fā)作導(dǎo)致大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡、壞死及丟失，然而機(jī)制尚不明確[2～4]。鈉氫交換體-1（Na+/H+exchanger-1，NHE1）屬于NHE家族成員[5]。Kang等[6]在癲癇易感性沙鼠癇性發(fā)作后取海馬進(jìn)行研究，結(jié)果顯示海馬中NHE1蛋白在癲癇發(fā)作3 h明顯升高，6 h恢復(fù)正常，提示NHE1蛋白增高可能與癲癇發(fā)作密切相關(guān)。本課題組前期研究證實(shí)顳葉外側(cè)癲癇患者腦組織m-calpain和μcalpain蛋白表達(dá)增高[7,8]，既往研究證實(shí)calpian蛋白表達(dá)增高與神經(jīng)元凋亡、壞死等病理變化密切相關(guān)[9]。calpain表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)是通過(guò)鈣信號(hào)通路調(diào)控的。NHE1可以通過(guò)對(duì)鈣信號(hào)通路的調(diào)控直接或間接影響calpain蛋白表達(dá)，因此本組推測(cè)NHE1可能通過(guò)調(diào)控calpain的表達(dá)影響細(xì)胞凋亡及壞死的發(fā)生。目前尚未見NHE1在顳葉外側(cè)癲癇患者手術(shù)切除大腦標(biāo)本中表達(dá)特點(diǎn)相關(guān)研究。本課題組收集顳葉外側(cè)癲癇患者手術(shù)切除大腦標(biāo)本，探討NHE1在顳葉外側(cè)癲癇患者腦組織中的表達(dá)特點(diǎn)，并對(duì)腦組織進(jìn)行凋亡的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組

貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)已審批本實(shí)驗(yàn)，倫理批件號(hào)No.146。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守倫理委員會(huì)要求。選取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科16例顳葉外側(cè)癲癇患者作為癲癇組，10例顳葉腫瘤和腦出血患者作為對(duì)照組。

癲癇組包括男10例，女6例；年齡11～48歲，平均（40.34±7.45）歲；簡(jiǎn)單部分性發(fā)作患者2例，復(fù)雜部分性發(fā)作患者7例，部分性發(fā)作繼發(fā)全面性發(fā)作患者7例。入組條件[10]：①具有典型臨床表現(xiàn)，腦電圖提示單側(cè)顳區(qū)放電；②用3種及以上的臨床常用抗癲癇藥（左乙拉西坦、奧卡西平、丙戊酸、拉莫三嗪等藥物），癲癇門診治療2年及以上，但仍有發(fā)作，每月2次以上；③病人及其家屬知情同意且簽署相關(guān)協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①顱內(nèi)與癲癇發(fā)作相關(guān)的感染性疾病可能；②合并有嚴(yán)重精神病病史；③家屬或者患者本人不同意。16例患者均接受單側(cè)部分顳葉手術(shù)切除，切除的顳葉組織作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

對(duì)照組中男7例，女3例；年齡14～55歲，平均（38.45±5.75）歲。標(biāo)本來(lái)源于顳葉腫瘤或者顳葉腦出血手術(shù)患者，并以病灶周邊相對(duì)正常腦組織作為對(duì)照。該組所有患者符合下列條件：①腦組織HE染色基本正常；②病人及其家屬知情同意并簽署相關(guān)協(xié)議書。

兩組患者基線資料詳見表1～2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示年齡無(wú)顯著差別（P>0.05）。

表1 16例顳葉外側(cè)癲癇患者臨床特點(diǎn)Tab.1 Clinical characteristics of 16 patients with lateral temporal lobe epilepsy

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人腦組織處理 切除的腦組織分成小塊，部分腦組織塊用滅菌錫箔紙包裹于-80℃冰凍儲(chǔ)存，應(yīng)用于RT-PCR和Western blot檢測(cè)；部分腦組織用生理鹽水沖洗后以多聚甲醛固定，然后梯度葡萄糖脫水，液氮冷凍然后進(jìn)行組織切片，切片厚度10μm，切片貼于聚賴氨酸包被的載玻片上，-80℃保存，用于免疫熒光檢測(cè)；部分腦組織采用石蠟包埋，包埋塊切片厚5 μm，用于免疫組化分析。

表2 10例對(duì)照組臨床特點(diǎn)Tab.2 Clinical characteristics of 10 cases in the control group

1.2.2 HE染色與免疫組化 石蠟切片在二甲苯中脫蠟，并于檸檬酸鈉緩沖液（10 mmol/L，pH 6）中以微波爐加熱10 min（98℃）進(jìn)行抗原修復(fù)。在37℃恒溫浴箱內(nèi)，切片置0.3%H2O2中孵育10 min，然后用0.4%Triton X-100（Sigma）處理15 min，加入山羊血清針對(duì)非特異性抗原進(jìn)行封閉（中杉金橋）。將切片與兔抗人NHE1的主要抗體（1：50；GeneTex）4℃孵育過(guò)夜。用PBS洗滌3次后，鼠抗兔二級(jí)抗體37℃孵育30 min，親和素-生物素復(fù)合液（中山金橋）37℃孵育30 min，PBS洗滌。用二氨基苯并胺（中杉金橋）檢測(cè)免疫反應(yīng)性，蘇木精復(fù)染。質(zhì)膜呈棕色染色的細(xì)胞被認(rèn)為是NHE1表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞。作為陰性對(duì)照，用PBS代替原發(fā)性或繼發(fā)性抗體[10]。用PM 20自動(dòng)顯微鏡（奧林巴斯，日本）采集圖像。

1.2.3 免疫熒光染色 取出冰凍切片，室溫晾干，然后用PBS緩沖液沖洗，5 min后將切片浸泡于枸櫞酸鈉緩沖液（0.01 mol/L，pH 6.0），放于微波爐中選擇高火煮沸，5 min后再調(diào)至低火煮沸15 min，隨后取出在室溫下冷卻。0.4%Triton X-100（Sigma）37℃孵育，15 min后加入山羊血清（中杉金橋）37℃封閉非特異性抗原，甩掉多余血清，將配好的混合一抗滴入后4℃過(guò)夜。兔抗人NHE1（1：100，GeneTex），與Neun（神經(jīng)元標(biāo)志物）的混合，小鼠抗人Neun抗體（1：50，Abcam）。次日，在37℃水浴箱復(fù)溫，1 h后沖洗一抗，滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1：100，中杉金橋）和TRITC標(biāo)記的猴抗小鼠二抗（1：100，中杉金橋），將混合抗體在37℃避光孵育1 h，然后沖洗二抗，最后用50%甘油封片[8]。

1.2.4 蛋白印跡（Western blot）取出冰凍腦組織，磨碎腦組織，按試劑盒說(shuō)明書提取腦組織中的蛋白（總蛋白提取試劑盒，凱基），用BCA試劑測(cè)定所提取的蛋白濃度（碧云天）。從樣品中提取50μg蛋白于8%SDS-PAGE上跑電泳，并電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。室溫下用5%BSA孵育PVDF纖維膜1.5 h，然后用兔抗人一抗NHE1（1：4000，GeneTex），和β-actin（1：1000，Santa Cruz）孵育PVDF膜4℃過(guò)夜；次日，室溫下孵育NHE1膜，然后加入山羊抗兔二抗（1：5000，中杉金橋）中2 h。同樣方法應(yīng)用兔多克隆一抗Bcl-2（1：4000，GeneTex）和Bax（1：4000，GeneTex）。在暗室中加入ECL顯色試劑（Pierce公司）對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯影。用Quantity One 4.6.2軟件分析NHE1的相對(duì)含量，βactin作為內(nèi)參[10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

收集數(shù)據(jù)，采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料表達(dá)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（），如數(shù)據(jù)為正態(tài)分布資料，兩組間的比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，兩組間比較應(yīng)用秩和檢驗(yàn)，以α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

癲癇組腦組織有神經(jīng)元丟失，小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增高，星型膠質(zhì)細(xì)胞增高（圖1B～D）；對(duì)照組顯示顳葉組織神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞未見明顯異常（圖1A）。

圖1 腦組織切片HE染色結(jié)果（標(biāo)尺100μm）A：對(duì)照組左側(cè)顳葉腦組織神經(jīng)元形態(tài)基本正常 B：癇患者1，左側(cè)顳葉腦組織大量神經(jīng)元濃縮壞死（箭頭）C：癲癇患者2，小膠質(zhì)細(xì)胞增生以及小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入壞死神經(jīng)元 D：癇患者3，箭頭示小膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)元丟失明顯Fig.1 The HE staining results of brain tissuesectionA:The morphology of neurons in the left temporal lobe was basically normal in the control group;B:Case 1,the left temporal lobe brain tissue,the black arrow indicated that a number of neurons were condensed and necrotic;C:Case 2,microglia proliferated and microglia entered into necrotic neurons;D:Case 3，the arrows indicated that microglia proliferated and neurons lost significantly.Scalebar 100μm

2.2 免疫組化和免疫熒光結(jié)果

癲癇組和對(duì)照組的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)均可見棕黃色的陽(yáng)性顆粒，集中于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，癲癇組平均OD值為（0.475±0.074），對(duì)照組平均OD值（0.215±0.052），二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見圖2。免疫熒光結(jié)果顯示腦組織中NHE1（紅色信號(hào)）和Neun（綠色信號(hào)）共定位，見圖3。

圖2 免疫組化結(jié)果（標(biāo)尺50μm）癲癇組（A）和對(duì)照組（B）神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)均可見棕黃色陽(yáng)性顆粒，集中于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿 C：計(jì)圖*P<0.05Fig.2 The results of immunohistochemistryThe neurons in the epileptic group(A)and the control group (B) had brownish yellow positive granules,which were mainly concentrated in the cell membrane and cytoplasm.C:Statistical diagram Scalebar 50μm

圖3 免疫熒光結(jié)果（標(biāo)尺50μm）癲癇患者切除的腦組織中NHE1在神經(jīng)元表達(dá)明確，箭頭示神經(jīng)元中NeuN和NHE1共表達(dá)（NeuN為神經(jīng)元標(biāo)志物）Fig.3 The results of immunofluorescenceThe expression of NHE1 in neurons wasclear(NeuN was the marker of neurons),and the white arrows showed the coexpression of NeuN and NHE1 in neurons,Scalebar 50μm

2.3 Western blot結(jié)果

Western blot結(jié)果提示癲癇組NHE1蛋白表達(dá)較對(duì)照組NHE1蛋白表達(dá)增高（P<0.05）。癲癇組Bcl-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組Bcl-2蛋白表達(dá)下降（P<0.05）；癲癇組Bax蛋白表達(dá)較對(duì)照組Bax蛋白表達(dá)增高（P<0.05），見圖4。

圖4 Western blot結(jié)果A：蛋白條帶B：NHE1蛋白定量C：Bcl-2蛋白定量D：Bax蛋白定量*P<0.05Fig.4 The results of Western blotA:Protein bands;B:Statistical diagram of the protein expression of NHE1；C:Statistical diagram of the protein expression of Bcl-2;D:Statistical diagram of the protein expression of Bax；*P<0.05

3 討論

NHE1是1989被克隆出來(lái)的蛋白，屬于NHE家族成員，表達(dá)在細(xì)胞膜上，在腦組織表達(dá)較廣泛[11]。NHE1作為細(xì)胞膜蛋白可以結(jié)合多種信號(hào)分子，結(jié)合后形成轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，可以對(duì)胞內(nèi)外信號(hào)做出快速而準(zhǔn)確的反應(yīng)[12,13,14]。最主要功能是防止細(xì)胞酸中毒，維持酸堿平衡。

本研究HE染色可見癲癇患者顳葉腦組織神經(jīng)元丟失，小膠質(zhì)細(xì)胞增多，衛(wèi)星現(xiàn)象明顯，星型膠質(zhì)細(xì)胞增生。免疫組化結(jié)果提示癲癇組NHE1表達(dá)較對(duì)照組增高，Western blot結(jié)果提示NHE1蛋白表達(dá)增高，且凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)增高，Bcl-2表達(dá)下降。提示NHE1參與癲癇的發(fā)生或者發(fā)展，可能與凋亡密切相關(guān)。既往神經(jīng)病理學(xué)專家研究顯示癲癇非腫瘤性病變是導(dǎo)致癲癇常見的原因，包括海馬硬化、皮質(zhì)發(fā)育畸形、Sturge-Weber綜合征和Rasmussen腦炎等，且HE染色可見神經(jīng)元丟失，膠質(zhì)細(xì)胞增生，海馬硬化等等表現(xiàn)[4,15]。本研究與之一致。Li等學(xué)者[16]研究發(fā)現(xiàn)癲癇模型鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡及自噬明顯，且自噬發(fā)生在凋亡之后。本研究也發(fā)現(xiàn)在癲癇患者腦標(biāo)本中凋亡現(xiàn)象明確。

本研究采用不同方法學(xué)手段，從組織學(xué)、分子生物學(xué)層面均證實(shí)NHE1表達(dá)在癲癇患者腦組織中表達(dá)是明顯增高的。NHE1結(jié)構(gòu)分為跨膜區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)區(qū)域。其功能為將胞內(nèi)的H+和胞外的Na+進(jìn)行進(jìn)行1：1交換，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的酸堿度[17]。NHE1表達(dá)增高，調(diào)控細(xì)胞酸堿平衡的功能增強(qiáng)。該結(jié)果提示NHE1表達(dá)增高可能改善神經(jīng)元在癇性放電后所致的酸中毒，把H+排出去，把Na+交換進(jìn)來(lái)。當(dāng)過(guò)度的Na+進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Na+超載也會(huì)刺激Na+/Ca2+交換體（NCX）活性增強(qiáng)，從而增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[13]。結(jié)合本課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)元凋亡、壞死等病理變化密切相關(guān)的m-calpain和μ-calpain蛋白表達(dá)增高[7,8]。神經(jīng)元內(nèi)Ca2+離子濃度變動(dòng)較大時(shí)，可以激活m-calpain和μ-calpain蛋白，進(jìn)而促發(fā)水解酶對(duì)細(xì)胞骨架和相關(guān)蛋白質(zhì)產(chǎn)生降解作用，從而破壞結(jié)構(gòu)蛋白以及酶的功能，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡或壞死。

綜合上述分析，本課題組認(rèn)為NHE1可能機(jī)制如下：由于神經(jīng)元反復(fù)放電后缺血缺氧，神經(jīng)元內(nèi)呈現(xiàn)酸化狀態(tài)，NHE1被激活，NCX活性增強(qiáng)，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+濃度超載。Ca2+進(jìn)一步激活mμ-calpain最終導(dǎo)致Bax蛋白表達(dá)增高，以及Bcl-2蛋白表達(dá)下降，凋亡發(fā)生。

本研究有不足之處。該研究是基于臨床標(biāo)本推測(cè)發(fā)病機(jī)制，無(wú)法開展機(jī)制相關(guān)研究，也無(wú)法進(jìn)行相關(guān)干預(yù)研究。在進(jìn)一步的動(dòng)物及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中將深入探討發(fā)病機(jī)制。

總之，NHE1表達(dá)增高可能是癲癇發(fā)生和發(fā)展的促發(fā)因素，在癲癇反復(fù)發(fā)作過(guò)程中，為維持酸堿平衡，過(guò)度激活導(dǎo)致鈣離子激活，促進(jìn)凋亡發(fā)生可能性較大。本研究為進(jìn)一步深入探討癲癇機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)，同時(shí)有助于NHE1相關(guān)藥物的研發(fā)。