牟娟 李健田 毛子春

摘要：目的 創(chuàng)建應用HPLC法對“補氣養(yǎng)血合劑” 中含有的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1（后文稱“4種皂苷”）進行含量測定的方法。方法 采用HPLC法。色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（長度：250 mm，直徑：4.6 mm，孔徑：5μm），P.N.959990—902。柱溫：30℃。流速：1.0 mL/min。檢測波長：203nm。進樣量：10μL。流動相：水（A）—乙腈（B），程序洗脫。結果 三七皂苷R1：線性關系在0.0829—2.0454μg范圍內良好（R=0.9995）。平均加樣回收率為：95.17%（RSD為0.65%，n為6）。人參皂苷Rg1：線性關系在0.2944—5.1263μg范圍內良好（R=0.9999）。平均加樣回收率為：96.81%（RSD為1.17%，n為6）。人參皂苷Rf：線性關系在0.0039—0.0586μg范圍內良好（R=0.9993）。平均加樣回收率為：104.05%（RSD為1.78%，n為6）。人參皂苷Rb1：線性關系在0.2350—3.5256μg范圍內良好（R=0.9999）。平均加樣回收率為：96.61%（RSD為1.33%，n為6）。結論 創(chuàng)建了應用HPLC法對“補氣養(yǎng)血合劑”中含有的4種皂苷進行含量測定的可信度較高的方法。

關鍵詞：三七皂苷R1;含量測定;人參皂苷Rg1;人參皂苷Rf;補氣養(yǎng)血合劑;人參皂苷Rb1;HPLC法

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2021）05-0073-05

“補氣養(yǎng)血合劑”系醫(yī)院多年使用協(xié)定處方，臨床效果顯著。方中使用了“三七”、“人參”兩味藥材;具有“活血益氣，補肝腎”等功效?！吨袊幍洹罚?015年版）一部收載的“三七”藥材，載有“散瘀止血，消腫止痛”等功效;“人參”載有“生津養(yǎng)血”等功效[1]?！把a氣養(yǎng)血合劑”目前在標準制訂研究階段，使用HPLC法對補氣養(yǎng)血合劑中人參、三七含有的4種皂苷進行含量測定。對“補氣養(yǎng)血合劑”作進質量控制。對色譜條件、提取方法等進行考察，來確保實驗方法的可靠性、準確性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（四元泵，DAD檢測器，自動進樣器），Agilent1260化學工作站;萬分之一分析天平（賽多利斯BP211D-OCE）。

1.2 試藥 補氣養(yǎng)血合劑（醫(yī)院自制）;人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201128，中國食品藥品檢定研究院，含量以91.1%計）;人參皂苷Rf標準品（批號：110719-201505，中國食品藥品檢定研究院）;人參皂苷Rb1標準品（批號：110704-201726，中國食品藥品檢定研究院，含量以92.4%計）三七皂苷R1標準品（批號：110745-201128318，中國食品藥品檢定研究院，含量以94.0%計）;乙腈、甲醇（色譜純）;其他化學試劑為分析純;水為超純水。

2 方法條件選擇與結果

2.1 檢測波長的確定 需要檢測的補氣養(yǎng)血合劑中含有的這4種皂苷主要來自處方中的三七和人參，本實驗方法的檢測波長確定為203nm。是參考《中國藥典》（2015年版）一部収載的用HPLC法測定“三七”、“人參”中這4種皂苷的含量的方法。

2.2 色譜條件的確定

2.2.1 流動相 本次實驗首先參考《參考《中國藥典》（2015年版）一部収載的“三七”、“人參”標準中含量測定時的流動相。開展后對梯度洗脫的流動相比例以及比例轉化時間進行了一系列的探索[11]，最終篩選出適合此次實驗的如“表1”所示的梯度洗脫程序。使用其他條件洗脫程序，出現(xiàn)樣品中目標物質的吸收峰均分不開，有相鄰的吸收峰合并等問題。

2.2.2 柱溫 設置25、27、30℃進行篩選[10]，25、27℃目標物質的分離度小于1.5。柱溫為30℃時，分離度才達到要求，柱溫確定30℃。

2.2.3 色譜柱 多次實驗確定使用ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，分離效果好達到要求。

3 溶液的配制

3.1 樣品溶液的準備 使用不同的溶劑如三氯甲烷、乙醚、水飽和的正丁醇等提取，采取大孔樹脂柱、氨試液等方法洗脫雜質。進行實驗反復對比、優(yōu)化最終確認樣品制備方法如下。

精密量取樣品10 mL，用三氯甲烷萃取3次，每次10 mL，棄去三氯甲烷液。再用水飽和的正丁醇萃取3次，每次20 mL;合并水飽和的正丁醇液，再用氨試液60 mL萃取，棄去氨試液;再取適量水飽和的正丁醇來洗滌分液漏斗，收集洗滌液。合并水飽和的正丁醇液于蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸干。殘渣用甲醇溶解至10 mL容量瓶，甲醇定容至刻度、搖勻、濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2 標準品溶液的準備 分別精密稱取一定質量4種皂苷的標準品，加甲醇使其溶解于適當?shù)娜萘科俊Ｔ儆眉状级ㄈ葜量潭?，制成一定濃度的“單一成分標準品溶液”。精密量取一定體積上述“單一成分標準品溶液”于同一適當?shù)娜萘科?，甲醇定容至刻度。作為“混合標準品溶液”?！?/p>

3.3 陰性對照溶液的準備 根據(jù)“補氣養(yǎng)血合劑”的處方。只去除“三七”、“人參”藥材。其他的條件不變。按“補氣養(yǎng)血合劑”的制作方法制作。制成“缺三七和人參的補氣養(yǎng)血合劑”。按“3.1”項制備，來作為陰性對照溶液。

4 色譜條件及系統(tǒng)適應性

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（長度： ?[LL]250 mm，直徑：4.6 mm，孔徑：5μm），P.N.959990—902。柱溫：30℃。流速：1.0 mL/min。檢測波長：203nm。進樣量：10μL。流動相：水（A）—乙腈（B）。按“表1”中程序進行梯度洗脫。三七皂苷R1的保留時間為32.75 min。人參皂苷Rg1的保留時間為44.91 min。人參皂苷Rf的保留時間為69.85 min。人參皂苷Rb1的保留時間為87.41 min。分離度均大于1.5。缺三七、缺人參的補氣養(yǎng)血合劑作為陰性對照。在32.75、44.91、69.85、87.41 min處無吸收峰干擾。如“圖1”所示。

5 方法學研究

5.1 專屬性考察 按照上述色譜條件，分別取3.1、3.2、3.3項下溶液進樣，采集色譜圖（見圖1），由圖可知，陰性對照色譜（缺三七、人參）在對照品相應出峰位置上處無干擾峰，對測定干擾小，系統(tǒng)誤差小;對照品、樣品色譜圖（Rt=32.75、44.91、69.85、87.41 min）分離效果良好，本實驗方法專屬性強。

Ⅰ：4種皂苷的混合對照.Ⅱ：補氣養(yǎng)血合劑樣品.Ⅲ：缺三七和人參的補氣養(yǎng)血合劑.

5.2 線性關系考察 用 上述確定的色譜條件。測定不同濃度的混合對照品。以三七皂苷R1標準品的含量作為橫坐標，對應峰面積為縱坐標。繪制標準曲線[8-10]。結果如“表2”、“圖2”所示。以人參皂苷Rg1標準品的含量作為橫坐標，其對應峰面積為縱坐標。繪制標準曲線。結果如“表3”、“圖3”所示。以人參皂苷Rf標準品的含量作為橫坐標，其對應峰面積為縱坐標。繪制標準曲線。結果如“表4”、“圖4”所示。以人參皂苷Rb1標準品的含量作為橫坐標，其對應峰面積為縱坐標。繪制標準曲線。結果如“表5”、“圖5”所示?；貧w方程為：三七皂苷R1：y=407.18x-3.6129，線性關系在0.0829—2.0454μg范圍內良好（R=0.9995）。人參皂苷Rg1：y=504.32x+31.652，線性關系在0.2944—5.1263μg范圍內良好（R=0.9999）。人參皂苷Rf：y=498.04x+1.4303，線性關系在0.0039—0.0586μg范圍內良好（R=0.9993）。人參皂苷Rb1：y=429x+0.1306，線性關系在0.2350—3.5256μg范圍內良好（R=0.9999）。

5.3 穩(wěn)定性考察 用準備好的同一樣品溶液，用上述的色譜條件。分別在0、2、4、8、24h進樣。來測定樣品中含有的4種皂苷的峰面積。計算4種皂苷峰面積的RSD如“表6”所示。依次為：三七皂苷R1為1.44%。人參皂苷Rg1為0.49%。人參皂苷Rf為1.53%。人參皂苷Rb1為0.69%。說明了樣品溶液在24h內比較穩(wěn)定。

5.4 精密度試驗 用“混合對照品溶液”。按上述的色譜條件。測定4種皂苷的吸收峰面積。連續(xù)測定6次。然后計算4種皂苷的峰面積RSD如“表7”所示。依次為：三七皂苷R1為0.86%。人參皂苷Rg1為0.57%。人參皂苷Rf為1.41%。人參皂苷Rb1為0.62%。說明了使用“2.1”的色譜條件。該儀器的精密度比較良好。

5.5 重復性考察 用準備好的同一批次的6份樣品溶液，用上述的色譜條件。檢測4種皂苷的峰面積。計算他們的平均含量及RSD值如“表8”所示。結果依次為：三七皂苷：含量=0.0847 mg/mL，RSD=1.45%。人參皂苷Rg1：含量=0.3246 mg/mL，RSD=0.98%。人參皂苷Rf：含量=0.0033 mg/mL，RSD=1.49%。人參皂苷Rb1：含量=0.3087 mg/mL，RSD=0.97%。說明此次實驗的方法具有比較良好的重復性。

5.6 加樣回收率考察 精密量取5 mL已知含量的樣品于分液漏斗中。再精密量取適量的“混合標準品溶液”加入其中。按“3.1”樣品溶液的準備方法，準備6份溶液。作為加樣回收試驗的溶液。用上述的色譜條件。進行吸收峰面積的檢測。然后計算平均加樣回收率如“表9”、“表10”、“表11”、“表12”所示。

5.7 供試品含量測定 用3個批次的樣品按“3.1”樣品溶液的準備方法，各準備2份樣品溶液。采用上述的色譜條件。對樣品中含有的4種皂苷峰面積進行了2次檢測。然后計算出他們的平均含量如“表13”所示。

6 結論

本試驗采用DAD UV HPLC色譜法測定樣品中 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf、人參皂苷Rb1的含量，本檢驗方法得到的標準工作曲線相關系數(shù)為0.9999，精密度的RSD值小于1.5%，重復性的RSD值0.4%，加標回收率在95.0%～105.0%間。該方法適用“補氣養(yǎng)血合劑”中含有4種皂苷的含量測定?？尚哦容^高，對“補氣養(yǎng)血合劑”的標準起草及質量控制有著重要的意義。

7 討論

對處方中同時調配三七和人參2味中藥情況，無論是在制劑還是臨床方劑中不多見。在常見的質量標準中三七含量測定成分為人參皂甙Rb1、Rg1、三七皂甙R1三者總和，三七皂甙R1為三七鑒別的專屬性指標成分;人參含量測定成分為人參皂甙Rg1、Rb1、Re三者總和，人參皂甙Rf為人參鑒別的專屬性指標成分。本次實驗研究在選取含量測定控制指標性成分時選定三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rf 四個對照物質進行控制，便于對處方中的三七和人參質量控制。但因在同一方法中控制指標多，在樣品分離度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等方面要求高、難度較大;對檢測設備的性能要求較高。

對樣品提取環(huán)節(jié)也有要求，皂苷類物質在溶液中穩(wěn)定性不高容易發(fā)生分解。在質量標準研究階段可以通過精細控制達到不同批次樣品差異性不大。但在中試及大生產(chǎn)過程中不易控制，須在藥品研發(fā)生產(chǎn)工藝時總體控制調節(jié)：如調節(jié)溶液pH值、在提取環(huán)節(jié)進一步純化中間品等，進一步改善藥品的穩(wěn)定性。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中國人民共和國藥典[S].1部.中國醫(yī)藥科技出版社.

[2]劉穎.應用HPLC法對參烏合劑中人參皂苷Rb1、Rg1含量測定的研究[J].中國處方藥，2018，12（16）：33-34.

[3]潘俊杰，鄭琴，陽明.三七中三七總皂苷的提取、分離純化及分析方法的研究進展[J].世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007.9（6）：77-82.

[4]劉鳳艷，張二勇，周波，等.皂苷提取分離新技術研究進展[J].遼寧化工，2009，38（1）：60-61.

[5]蔡芷辰，周艷麗，李振麟，等.HPLC法同時測定9個不同產(chǎn)區(qū)人參花中5種皂苷含量[J].中醫(yī)藥導報，2019，25（2）：86-88.

[6]韓利平，高家榮，李靜雯，等.HPLC法同時測定黃安消膠囊中4種化學成分的含量[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2018，30（3）：475-478.

[7]艾強，雷陽，張厚才，等.HPLC法測定三七總皂苷含量[J].現(xiàn)代農業(yè)科技，2016（14）：274-275.

[8]田蜜，陳芳，賀健昌.HPLC法測定黃七化瘀丸中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1的含量[J].吉林中醫(yī)藥，2018，38（11）：1319-1322.

[9]焦傳新，袁武，黃任嵩，等.人參花中人參皂苷Re和Rg1成分提取工藝優(yōu)選[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2019，15（1）：60-62.

[10]朱連連，欒曉寧，竇德強.黑參中人參皂苷Rg3、的含量測定[J].中國現(xiàn)代中藥，2019（3）：323-327.

[11]劉夢楠，薛雪，熊慧，等.不同凈制工藝對三七質量的影響[J].世界中醫(yī)藥，2019，14（2）：297-300.