李萌萌，萬碧江

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種病因不明的、慢性全身性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為對(duì)稱性、破壞性的小關(guān)節(jié)病變及慢性炎癥。其基本病理改變?yōu)槁曰ぱ装Y及滑膜組織增生[1]?，F(xiàn)臨床多采用抗炎及抗風(fēng)濕藥物治療，雖然在抑制炎癥發(fā)展、減輕關(guān)節(jié)疼痛和延緩疾病進(jìn)展等方面取得了良好的治療效果，但仍有部分患者表現(xiàn)出進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷或?qū)λ幬锂a(chǎn)生不良反應(yīng)[2]，仍然需要尋找新的治療選擇。針刀療法創(chuàng)始人朱漢章教授在《針刀醫(yī)學(xué)原理》中提出，針刀治療對(duì)RA有良好的療效，可快速緩解因關(guān)節(jié)內(nèi)炎性滲出引起的關(guān)節(jié)腫脹、疼痛并恢復(fù)關(guān)節(jié)功能[3]。臨床研究證實(shí)針刀治療RA療效確切[4-6]，RA是針刀療法的優(yōu)勢(shì)病種之一[7]。但目前針對(duì)針刀治療RA的內(nèi)在機(jī)制研究尚未見報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)采用牛Ⅱ型膠原乳化劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)的方法建立RA大鼠模型，觀察其自然病程及針刀干預(yù)對(duì)CIA大鼠的影響，探討針刀治療RA的可能機(jī)制，以利于針刀療法的推廣應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌性大鼠30只，體質(zhì)量180～200 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012。飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，自然光線，自由進(jìn)食飲水，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑

膠原蛋白II型(牛)(美國SIGMA，貨號(hào)：CJ7806)；弗氏不完全佐劑(美國SIGMA，貨號(hào)：100242-200402)；TRIzol?Reagent(美國Ambion，貨號(hào)：15596-026)；超純RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)：CW0581S)；PowerUpTMSYBR?Green Master Mix(美國Thermo Scientific，貨號(hào)：A25742)；DEPC水(Biosharp，貨號(hào)：BL510A)。

1.3 主要儀器

一次性漢章系列無菌針刀(0.4 mm×30 mm，北京健力園醫(yī)療器械有限公司)；5700型熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)；JEM-1400透射電子顯微鏡(日本電子 JEOL)；艾科浦超純水制成機(jī)(美國艾科浦國際有限公司)；ZQP-86振動(dòng)切片機(jī)(上海之信儀器)；CP100WX超速離心機(jī)(日立)；Nilcoh990數(shù)碼相機(jī)(康尼公司)。

1.4 分組與造模方法

適應(yīng)性飼養(yǎng)動(dòng)物1周后，將30只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組和針刀組，按文獻(xiàn)記載建造CIA大鼠模型[8]。制備Ⅱ型乳劑：將10 mgⅡ型膠原蛋白溶解于5 mL 0.1 mol/L乙酸溶液中，4 ℃過夜，次日將膠原溶液和弗氏不完全佐劑按1∶1比例混勻，制成Ⅱ型膠原乳劑，濃度為1 mg/mL，4 ℃保存。造模：用體積分?jǐn)?shù)為1%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，在模型組、針刀組大鼠左后足跖皮內(nèi)注射Ⅱ型膠原乳劑0.1 mL進(jìn)行初次免疫，空白組于相同部位皮內(nèi)注射等量生理鹽水。初次免疫7 d后行強(qiáng)化免疫，藥物注射部位、用量和方法同前；初次免疫14 d后評(píng)價(jià)造模結(jié)果。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 空白組 正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)處理。

1.5.2 模型組 造模成功后正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)處理。

1.5.3 針刀組 造模成功后，針刀組大鼠使用自制鼠衣固定，在左側(cè)大鼠患膝行觸診，于關(guān)節(jié)周圍找到條索狀物并用龍膽紫定點(diǎn)，每次選3點(diǎn)，常規(guī)備皮，消毒，按四步進(jìn)針規(guī)程操作進(jìn)針，然后行縱向疏通及橫向剝離2～3刀治療，最后避開神經(jīng)及血管，用針刀將關(guān)節(jié)囊切開數(shù)點(diǎn)，放出少許關(guān)節(jié)液，出針后以消毒棉簽按壓針孔1 min，敷以創(chuàng)可貼固定，再輔以手法治療放松膝關(guān)節(jié)周圍軟組織。針刀組大鼠于初次免疫后第15天開始接受針刀干預(yù)治療，每周治療1次，共治療3次。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 各組大鼠足跖厚度及AI評(píng)分 初次免疫后定期用千分游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠左下肢足跖厚度，觀察大鼠足跖腫脹程度在免疫過程中及針刀治療前后的變化，并拍照記錄。初次免疫后定期根據(jù)AI評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)[9-10]對(duì)各組大鼠行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，大鼠前后四肢足趾的紅腫程度分別按0～4分計(jì)算。根據(jù)四肢累計(jì)積分算出AI值，最高分為16分。AI值越高，則代表病情越嚴(yán)重。評(píng)分≥4分提示造模成功。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6.2 HE染色法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)病理變化情況 針刀組治療結(jié)束后，隨機(jī)選取空白組、模型組和針刀組大鼠各5只，取致炎側(cè)(左側(cè))膝關(guān)節(jié)除去多余的皮毛及軟組織，用PBS緩沖液洗去血液和殘?jiān)?，置?%多聚甲醛中固定1周后，將組織轉(zhuǎn)移至20～30倍體積的EDTA脫鈣液中6～8周，如大頭針能輕松刺入關(guān)節(jié)則脫鈣滿意，然后縱置關(guān)節(jié)，常規(guī)脫水、透明后進(jìn)行石蠟包埋，振動(dòng)切片機(jī)5 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織病理形態(tài)變化。

1.6.3 Caspase-3、Caspase-9 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(real-time quantitative PCR,q-RT-PCR法)法檢測(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜組織中Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達(dá)。取余空白組、模型組和針刀組大鼠左膝關(guān)節(jié)滑膜組織100 mg，在研缽中加液氮充分研磨，用Trizol法提取滑膜組織總RNA，按cDNA合成試劑盒說明書操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，運(yùn)用SYBR Green I染料法，在熒光定量PCR儀上，以β-actin基因作為內(nèi)參對(duì)照，進(jìn)行各目的基因的定量檢測(cè)，PCR引物序列見表2，由昆泰銳(武漢公司)合成，反應(yīng)總體系為20 μL，反應(yīng)擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 2 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s和72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束獲得Caspase-3、Caspase-9的循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct)，采用2-ΔΔCt公式計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表2 RT-PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 針刀干預(yù)對(duì)CIA大鼠足趾厚度及AI的影響

如圖1～2、表3～4，根據(jù)觀察及測(cè)量結(jié)果，空白組大鼠無關(guān)節(jié)腫脹、皮損及關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙等表現(xiàn)；模型組大鼠初次免疫后3～6 d出現(xiàn)造模側(cè)足跖皮膚潰破，后出現(xiàn)足趾、足踝和膝關(guān)節(jié)紅腫，于8～10 d紅腫加重，并逐漸向?qū)?cè)及雙前肢蔓延，初次免疫后21 d左右紅腫達(dá)到頂峰，皮膚充血發(fā)亮，并持續(xù)存在；針刀組大鼠于第1次針刀干預(yù)后即初次免疫后21 d開始，大鼠足趾厚度及AI值較模型組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示針刀干預(yù)可明顯改善CIA大鼠足趾腫脹程度。

圖1 針刀干預(yù)對(duì)CIA大鼠足趾厚度及AI的影響

表3 針刀干預(yù)對(duì)CIA大鼠足跖厚度的影響

表4 針刀干預(yù)對(duì)CIA大鼠AI的影響

圖2 各組CIA大鼠足跖厚度變化情況

2.2 針刀干預(yù)對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)病理變化的影響

如圖3，空白組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜呈單層細(xì)胞排列，未見增生及炎性細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)腔內(nèi)無滲出，無血管翳形成，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，無關(guān)節(jié)破壞；模型組大鼠滑膜組織滑膜層增厚，表面不平整，其中有大量炎性細(xì)胞浸潤，多見淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，新生血管增多，并可見軟骨侵蝕現(xiàn)象；針刀組大鼠滑膜細(xì)胞增生反應(yīng)改善，滑膜層數(shù)減少，炎性細(xì)胞對(duì)滑膜的浸潤緩解，新生血管數(shù)少，軟骨表面較光滑。

注:A：空白組(200×)；B：模型組(200×)；C：針刀組(200×)；D：空白組(400×)；E：模型組(400×)；F：針刀組(400×)。圖3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理形態(tài)比較(HE染色)

2.3 針刀干預(yù)對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)的影響

如表5，與空白組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；針刀組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平較模型組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但仍低于空白組水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織Caspase-3、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

RA是一種以反復(fù)發(fā)作的多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的人體自身免疫綜合征，若不予以干預(yù)治療，后期可引起不可逆的骨關(guān)節(jié)侵蝕，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。有研究表明，滑膜慢性炎癥和滑膜組織增生在RA的發(fā)病機(jī)理中起著核心作用[11]，是導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞的基本原因[12]。因此如何緩解滑膜組織炎癥、抑制滑膜細(xì)胞增殖是治療RA的突破點(diǎn)。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，痹者閉也?！端貑枴け哉摗诽岢觯骸帮L(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹”，其基本病機(jī)為正虛邪湊，風(fēng)寒濕雜至，經(jīng)絡(luò)氣血“不通”，治療原則以“通”為要。針刀療法作為將針刺療法的“針”和手術(shù)療法的“刀”融為一體的治療方法，將經(jīng)絡(luò)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的觀點(diǎn)和方法相結(jié)合，以經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)為主干，以閉合性手術(shù)的方式，通過松解關(guān)節(jié)囊、排出關(guān)節(jié)內(nèi)炎性滲出以降低關(guān)節(jié)內(nèi)部張力，從而達(dá)到“流暢氣血、祛邪養(yǎng)正、宣通脈絡(luò)”的作用[3]。本研究證明針刀干預(yù)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠有明確的治療效果。通過CIA大鼠足趾厚度檢測(cè)、AI評(píng)分以及關(guān)節(jié)病理切片觀察可發(fā)現(xiàn)針刀干預(yù)可明顯改善CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹，緩解炎性細(xì)胞對(duì)滑膜組織的浸潤。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族可對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行不可逆的裂解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)獲得或者喪失其功能，進(jìn)而協(xié)調(diào)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[13]。其中Caspase-3、Caspase-9在啟動(dòng)細(xì)胞死亡進(jìn)程的內(nèi)源性途徑中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠滑膜組織Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)量降低，與空白組對(duì)照明顯，提示滑膜組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)異常，滑膜組織內(nèi)細(xì)胞增殖和死亡之間的平衡失調(diào)，導(dǎo)致滑膜組織增生。針刀組大鼠滑膜組織Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)量較模型組明顯上調(diào)，提示針刀治療可能是通過內(nèi)源性途徑，激活Caspase-3、Caspase-9，促進(jìn)滑膜細(xì)胞進(jìn)入死亡程序，抑制滑膜組織的增生而發(fā)揮治療作用。

綜上所述，通過觀察針刀干預(yù)對(duì)CIA大鼠模型的影響，初步證明了針刀治療可通過上調(diào)滑膜細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)抑制滑膜組織增生，進(jìn)而緩解關(guān)節(jié)腫脹及炎性浸潤，為針刀治療RA提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但針刀治療RA機(jī)制復(fù)雜，尚有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。