于少藤,毛淑蕊,胡安妥,陸兆新,朱懷遠(yuǎn),孔梁宇,別小妹*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.湖南省益陽市煙草專賣局,湖南 益陽 413000;3.江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,江蘇 南京 210019)

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,其種植面積、總產(chǎn)量、卷煙產(chǎn)量及銷售量均居世界首位[1]。煙葉的品質(zhì)與其自身含有的許多大分子物質(zhì)有密切的關(guān)系[2],如蛋白質(zhì)、碳水化合物在高溫燃燒過程中轉(zhuǎn)化產(chǎn)生稠環(huán)芳烴、自由基和氮亞硝胺等有害的化合物,不僅對(duì)卷煙的品質(zhì)有巨大的影響,而且還會(huì)危害人體健康[3]。隨著人們健康意識(shí)不斷增強(qiáng),越來越多的消費(fèi)者更愿意吸食無毒、安全的煙草制品。因此,煙草行業(yè)需要采用行之有效的方法使煙草制品中的有害大分子化合物的含量向有利的方向發(fā)展,進(jìn)而提高煙草制品質(zhì)量和安全性[4]。

煙葉發(fā)酵是煙草行業(yè)用來提高煙葉質(zhì)量的主要加工手段,也是卷煙加工的重要步驟[5]。研究發(fā)現(xiàn),煙葉表面聚集著大量的種類豐富的微生物,而且這些微生物在煙草發(fā)酵過程中起著重要作用[6]。高品質(zhì)的煙葉表面微生物的數(shù)量龐大,種類繁多,它們?cè)谏L(zhǎng)發(fā)育的同時(shí)能夠合成分泌多種胞外降解酶,這些酶可以加快果膠、纖維素、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素等物質(zhì)的降解,從而轉(zhuǎn)化為一些有利于提高煙草品質(zhì)和安全性的小分子化合物,最終改變煙草的品質(zhì)[7-9]。人工添加有益微生物在煙葉加工中的作用為可縮短發(fā)酵和醇化時(shí)間以及改善煙葉品質(zhì)。如庹有朋等[10]篩選得到22株菌株用于煙葉發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵7個(gè)月就可達(dá)到現(xiàn)有發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵3年的效果,并起到了增香提質(zhì)的作用。王充等[11]利用造紙法再造煙葉濃縮液微生物,在30 ℃條件下振蕩發(fā)酵72 h,可明顯提高再造煙葉的香氣量,改善舒適度。陳小敏[12]從晾曬煙葉表面分離出一些產(chǎn)酶微生物并制成微生物制劑,發(fā)現(xiàn)其可明顯提高煙葉的吸食性。

為了獲得可同時(shí)降解煙葉中多種大分子化合物的菌株,本研究從不同產(chǎn)地、不同品種的煙葉中分離細(xì)菌,并對(duì)其產(chǎn)酶條件及作用效果進(jìn)行研究,以期為微生物發(fā)酵煙葉提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 煙葉用于菌株篩選的4種煙葉分別采自重慶彭水(2018年,編號(hào)A)、陜西商洛(2016年,編號(hào)B)、貴州畢節(jié)大方(2018年,編號(hào)C)、云南臨滄(2016年,編號(hào)D),由江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 主要試劑酪素購自北京酷來搏科技有限公司;D-半乳糖醛酸購自上海源葉生物科技有限公司;木質(zhì)素購自上海麥克林生化科技有限公司;其他試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基淀粉培養(yǎng)基:可溶性淀粉20.0 g,蛋白胨10.0 g,牛肉膏5.0 g,NaCl 5.0 g,1 000 mL去離子水,pH(7.0～7.2),115 ℃滅菌30 min。羧甲基纖維素鈉液體培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉10 g,(NH4)2SO44.0 g,蛋白胨1.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KH2PO41.0 g,瓊脂20 g,1 000 mL去離子水,115 ℃滅菌30 min。苯胺藍(lán)培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基中加入18 g·L-1瓊脂,1 g·L-1苯胺藍(lán)。酪蛋白培養(yǎng)基:酪素5 g,牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 10 g,瓊脂15 g,1 000 mL去離子水,pH(7.0～7.5),121 ℃高壓滅菌30 min。果膠培養(yǎng)基:果膠5.0 g,MgSO4·7H2O 2.0 g,K2HPO41.0 g,NH4Cl 0.4 g,FeSO40.01 g,1 000 mL去離子水,調(diào)pH值至7.0,121 ℃滅菌30 min。LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,瓊脂18 g,1 000 mL去離子水,121 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙葉中細(xì)菌的分離取適量煙葉樣品于三角瓶中,然后加入適量的無菌生理鹽水,將三角瓶放于搖床中,調(diào)節(jié)溫度至30 ℃,轉(zhuǎn)速為180 r·min-1,振蕩培養(yǎng)30 min得到菌懸液。取1 mL菌懸液加入9 mL的滅菌生理鹽水進(jìn)行稀釋,得到10-1的稀釋液,并逐步稀釋得到10-2、10-3、10-4的稀釋液。將不同濃度的稀釋液涂布于LB平板,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h(每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)平行),觀察菌落的生長(zhǎng)情況,挑選不同菌落形態(tài)的菌株進(jìn)行分離純化。

1.2.2 細(xì)菌降解能力的檢測(cè)將上述分離出的細(xì)菌劃線于LB平板上培養(yǎng)出單菌落,挑取單菌落分別點(diǎn)接在淀粉、纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)及果膠篩選固體培養(yǎng)基上,通過觀察菌落周圍是否有透明圈的產(chǎn)生判斷細(xì)菌是否降解相應(yīng)大分子。綜合上述結(jié)果挑選出可同時(shí)降解多種成分的細(xì)菌并保存。

1.2.3 種子液及粗酶液的制備將初篩得到的細(xì)菌接種于LB液體培養(yǎng)基中(調(diào)節(jié)D600為0.1),搖床溫度及轉(zhuǎn)速分別為37 ℃和180 r·min-1,培養(yǎng)12 h后獲得種子液;將種子液以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入100 mL的LB液體培養(yǎng)基中,相同條件下培養(yǎng)菌株48 h得到發(fā)酵液。取適量發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心10 min得到上清液,即為粗酶液。

1.2.4 細(xì)菌酶活性的測(cè)定淀粉酶、果膠酶和纖維素酶活性測(cè)定采用DNS法[13],蛋白酶活性測(cè)定采用福林酚法[14],木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)和錳過氧化物酶(MnP)活性測(cè)定采用付麗等[15]的方法。根據(jù)初篩菌株的各種降解酶活性高低進(jìn)行菌株復(fù)篩,選擇6種降解酶的酶活性均處于中高水平的菌株yc10進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)酶條件優(yōu)化及作用效果研究。

1.2.5 菌株的鑒定將菌株yc10接種于 LB 培養(yǎng)基上,待菌落長(zhǎng)出后,對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色[16],在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)特征。采用水煮法提取菌株的DNA。

以菌株yc10的DNA為模板，使用通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)及1429R(GGTTACCTTGTTACGACTT)擴(kuò)增其16S rDNA片段[17]。PCR反應(yīng)體系(25 μL):2×TaqMaster Mix 10 μL,上、下游引物各 1 μL,DNA模板2 μL,無菌水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,在NCBI基因庫中進(jìn)行菌株的同源性比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色結(jié)果及16S rDNA測(cè)序結(jié)果對(duì)菌株yc10進(jìn)行鑒定。

1.2.6 產(chǎn)酶條件優(yōu)化1)發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化。以1%的接種量將菌株yc10的種子液接種于100 mL的液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)菌株,于12、24、36、48和60 h時(shí)取樣,每組培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置3個(gè)平行。按照取樣時(shí)間取適量的發(fā)酵液,低溫離心獲得粗酶液,測(cè)定粗酶液中酶活性,得出菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間。

2)發(fā)酵溫度的優(yōu)化。以1%的接種量將菌株yc10的種子液接種于100 mL的液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)溫度設(shè)置為30、33、37、40和43 ℃,每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)平行,搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1條件下培養(yǎng)菌株至最佳發(fā)酵時(shí)間,取發(fā)酵液低溫離心獲得粗酶液,測(cè)定粗酶液中酶活性,得出菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)溫度。

3)pH值的優(yōu)化。使用pH電子顯示計(jì)測(cè)定LB液體培養(yǎng)基pH值,并用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH調(diào)整pH值為5、6、7、8和9,以1%的接種量將菌株yc10的種子液接種于100 mL的LB液體培養(yǎng)基中,每個(gè)pH設(shè)置3個(gè)平行,調(diào)節(jié)搖床溫度為最適的發(fā)酵溫度,180 r·min-1條件下培養(yǎng)菌株至最佳發(fā)酵時(shí)間,取發(fā)酵液低溫離心獲得粗酶液,測(cè)定粗酶液中酶活性,得出菌株產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵pH值。

4)接種量的優(yōu)化。將菌株yc10的種子液按照體積分?jǐn)?shù)2%、4%、6%、8%、10%的接種量接種于100 mL的液體培養(yǎng)基中,每個(gè)接種量設(shè)置3個(gè)平行,調(diào)節(jié)體系為最佳發(fā)酵pH值,調(diào)節(jié)搖床溫度為最適的發(fā)酵溫度,180 r·min-1條件下將菌株培養(yǎng)至最佳發(fā)酵時(shí)間,取發(fā)酵液低溫離心獲得粗酶液,測(cè)定粗酶液中酶活性,得出菌株產(chǎn)酶的最佳接種量。

5)裝液量的優(yōu)化。將菌株yc10的種子液按最佳接種量分別接種于60、80、100、120和140 mL的培養(yǎng)基中,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行,調(diào)節(jié)體系為最佳發(fā)酵pH值,調(diào)節(jié)搖床溫度為最適的發(fā)酵溫度,180 r·min-1條件下將菌株培養(yǎng)至最佳發(fā)酵時(shí)間,取發(fā)酵液低溫離心獲得粗酶液,測(cè)定粗酶液中酶活性,得出菌株產(chǎn)酶的最佳裝液量。

6)搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化。將菌株yc10的種子液按照最佳接種量接種于最適裝液量的培養(yǎng)基中,調(diào)節(jié)體系為最佳發(fā)酵pH值,分別設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為140、160、180、200和220 r·min-1,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行,設(shè)置搖床溫度為最佳培養(yǎng)溫度,將菌株培養(yǎng)至最佳發(fā)酵時(shí)間,取發(fā)酵液低溫離心獲得粗酶液,測(cè)定粗酶液中酶活性,得出菌株產(chǎn)酶的最佳轉(zhuǎn)速。

1.2.7 菌株yc10發(fā)酵液對(duì)煙葉中大分子化合物降解的效果將菌株yc10的種子液按照最佳產(chǎn)酶條件培養(yǎng)以獲得發(fā)酵液,稱取100 g煙葉,將30 mL發(fā)酵液均勻噴灑在煙葉表面,空白對(duì)照組僅噴灑LB液體培養(yǎng)基而不接種菌株。將煙葉放在37 ℃、65%濕度的恒溫恒濕箱中發(fā)酵48 h,發(fā)酵結(jié)束后將煙葉烘干粉碎,測(cè)定發(fā)酵前、后煙葉中大分子化合物的含量變化。煙葉中淀粉含量采用碘顯色法測(cè)定[18],纖維素含量測(cè)定采用安玉民等[19]的方法,木質(zhì)素含量測(cè)定采用木質(zhì)素含量試劑盒測(cè)定(索萊寶科技有限公司),蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用王萬能等[20]的方法,果膠含量測(cè)定采用果膠含量試劑盒測(cè)定(索萊寶科技有限公司)。

1.2.8 煙葉中香氣成分的測(cè)定將發(fā)酵前、后的煙葉A樣品送杭州研趣信息技術(shù)有限公司,使用固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用儀(島津,GCMS-QP2010 SE)進(jìn)行香氣成分的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

從4種煙葉樣品中分離出87株細(xì)菌,將分離出的細(xì)菌接種到不同種類的特定選擇性培養(yǎng)基中,測(cè)定細(xì)菌對(duì)淀粉、纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和果膠的降解能力,以菌株可同時(shí)降解物質(zhì)種類的多少作為篩選指標(biāo),共篩選出9株細(xì)菌可以同時(shí)降解煙葉中的淀粉、纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和果膠,分別為yc7、yc9、yc11、yc2、yc10、yc8、fc3、d11、X2。

對(duì)9株細(xì)菌所產(chǎn)生的6種降解酶活性進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果(圖1)顯示,不同細(xì)菌所產(chǎn)酶的酶活性沒有明顯的規(guī)律。由于菌株yc10的6種降解酶的酶活性均處于中高水平,所以選擇菌株yc10進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同菌株產(chǎn)生的6種酶的酶活性Fig.1 Enzyme activity of 6 enzymes produced by different strainsLiP:木質(zhì)素過氧化物酶Lignin peroxidase;MnP:錳過氧化物酶Mn-dependent peroxidase.下同。The same as follows.

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察菌株yc10可以在LB培養(yǎng)基上良好生長(zhǎng),且菌落呈淡黃色圓形,不透明,邊緣光滑,表面有褶皺。革蘭氏染色結(jié)果顯示yc10是革蘭氏陰性桿菌。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定提取菌株yc10的基因組DNA,使用通用引物擴(kuò)增16S rDNA序列后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果采用NCBI網(wǎng)站的BLAST進(jìn)行比對(duì),用MEGA 7.0軟件建立菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。菌株yc10與Pseudomonasgessardii(CIP 105469)的同源性達(dá)到99.4%,確定菌株yc10為蓋氏假單胞菌(Pseudomonasgessardii)。

圖2 基于菌株yc10的16S rDNA測(cè)序結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequencing results of strain yc10

2.3 菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化如圖3所示:當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為12～36 h時(shí),菌株yc10的淀粉酶、纖維素酶、果膠酶和木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而升高并達(dá)到最大值,最大酶活性分別為2.68、2.90、217.67 U·mL-1和23.71 U·L-1;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),各降解酶的活性逐漸降低。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在12～24 h時(shí),菌株yc10的錳過氧化物酶(MnP)和蛋白酶活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而升高并達(dá)到最大值,最大酶活性分別為30.05 U·L-1和12.06 U·mL-1。菌株yc10產(chǎn)生各種酶的酶活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)均呈先升高后下降的趨勢(shì),這可能是菌體需要消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來保證自身的生長(zhǎng)繁殖和代謝活動(dòng),隨時(shí)間延長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量降低而代謝產(chǎn)物大量積累,抑制了菌體的生長(zhǎng)和代謝。綜合考慮,菌株yc10產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵時(shí)間為36 h。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株yc10降解酶活性的影響Fig.3 Effects of different fermentation time on degrading enzyme activity of strain yc10不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as follows.

2.3.2 發(fā)酵溫度優(yōu)化如圖4所示:菌株yc10的淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶和果膠酶活性在發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)達(dá)到最大值,分別為2.92、2.77、12.08和230.63 U·mL-1,當(dāng)發(fā)酵溫度繼續(xù)升高時(shí),上述降解酶的活性逐漸降低。菌株yc10的 LiP和MnP活性分別在40 ℃和33 ℃達(dá)到最大值。較低的培養(yǎng)溫度會(huì)影響菌體的生長(zhǎng),使其達(dá)不到旺盛生長(zhǎng)階段,從而使菌株yc10的產(chǎn)酶減少;而溫度過高,菌體的生長(zhǎng)速度過快會(huì)加速營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗,使菌體過早衰亡,從而影響菌株產(chǎn)酶。綜合考慮,選擇37 ℃為菌株產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵溫度。

圖4 不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株yc10降解酶活性的影響Fig.4 Effects of fermentation temperatures on degrading enzyme activity of strain yc10

2.3.3 培養(yǎng)基pH值的優(yōu)化如圖5所示:隨著培養(yǎng)基pH值的升高,菌株yc10產(chǎn)生的各種降解酶的活性都呈先升高后降低的趨勢(shì)。淀粉酶、纖維素酶和MnP活性在pH值為7時(shí)達(dá)到最大值,分別為2.91、2.75 U·mL-1和24.88 U·L-1,而蛋白酶和果膠酶活性在pH值為8時(shí)達(dá)到最大值,分別為17.02和259.13 U·mL-1,LiP活性在pH值為6時(shí)達(dá)到最大值37.48 U·L-1。過高或過低的pH值都會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,不利于菌株代謝產(chǎn)物的積累。綜合考慮,菌株產(chǎn)酶的最佳pH值為7。

圖5 不同pH值對(duì)菌株yc10降解酶活性的影響Fig.5 Effect of different pH value on degrading enzyme activity of strain yc10

2.3.4 接種量的優(yōu)化如圖6所示:隨接種量的增加,菌株yc10的6種降解酶活性都呈先升高后降低的趨勢(shì),淀粉酶、纖維素酶、MnP和果膠酶的活性在接種量為6%時(shí)達(dá)到最大值,LiP活性在接種量為8%時(shí)達(dá)到最大值,蛋白酶活性在接種量為4%時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)菌株的接種量過高時(shí),會(huì)導(dǎo)致生物量迅速增長(zhǎng),培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分消耗過快不利于菌株細(xì)胞內(nèi)各種酶的合成;當(dāng)接種量過低時(shí),菌體生長(zhǎng)緩慢,產(chǎn)酶也較少。綜合考慮,菌株產(chǎn)酶的最佳接種量為6%。

圖6 不同接種量對(duì)菌株yc10降解酶活性的影響Fig.6 Effects of different inoculation amounts on degrading enzyme activity of strain yc10

2.3.5 裝液量的優(yōu)化如圖7所示:隨著裝液量的增加,菌株yc10的各降解酶活性均呈先升高后下降的趨勢(shì)。菌株yc10的淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶和果膠酶的活性均在裝液量為80 mL時(shí)達(dá)到最大值,而LiP和MnP活性則在裝液量為100 mL時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)培養(yǎng)基裝液量過低時(shí),培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以支撐菌株的生長(zhǎng)發(fā)育,使菌株產(chǎn)酶減少;當(dāng)培養(yǎng)基裝液量過多時(shí),使菌株生長(zhǎng)環(huán)境中的溶氧量不足,也會(huì)阻礙細(xì)菌的代謝活動(dòng),導(dǎo)致菌株產(chǎn)酶減少。綜合考慮,菌株yc10產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基裝液量為80 mL。

2.3.6 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化如圖8所示:隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加,6種降解酶的活性均呈先增加后降低的趨勢(shì)。菌株yc10的淀粉酶活性在轉(zhuǎn)速為160 r·min-1時(shí)達(dá)到最大值,纖維素酶、MnP和果膠酶的活性均在轉(zhuǎn)速為200 r·min-1時(shí)達(dá)到最大值,而LiP和蛋白酶的活性在轉(zhuǎn)速為180 r·min-1時(shí)達(dá)到最大值。綜合考慮,菌株產(chǎn)酶的最佳搖床轉(zhuǎn)速為200 r·min-1。

圖8 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株yc10降解酶活性的影響Fig.8 Effects of different rotation speeds on degrading enzyme activity of strain yc10

2.3.7 最佳產(chǎn)酶條件通過對(duì)菌株yc10的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化,得出其最佳產(chǎn)酶條件為:發(fā)酵時(shí)間36 h,發(fā)酵pH值7,發(fā)酵溫度37 ℃,接種量6%,裝液量80 mL,搖床轉(zhuǎn)速200 r·min-1。由表1可見:經(jīng)過發(fā)酵后菌株yc10的淀粉酶、纖維素酶、LiP、MnP、蛋白酶和果膠酶活性分別比優(yōu)化前提高了184.00%、233.00%、82.13%、122.00%、63.59%和212.00%。

表1 菌株yc10優(yōu)化前、后的降解酶活性Table 1 Degrading enzyme activity before and after optimization of production conditions of strain yc10

2.4 菌株yc10發(fā)酵液對(duì)煙葉中大分子化合物降解效果的影響

由表2可以看出:煙葉經(jīng)過yc10菌株發(fā)酵后,5類大分子化合物含量相比于發(fā)酵前均有所降低,發(fā)酵后煙葉A、B、D中果膠的降解效果較為顯著,降解率超過30%;4種煙葉中纖維素的降解效果次之,約為20%;淀粉的降解效果稍弱,但均超過10%;4種煙葉中木質(zhì)素的降解效率差異較大,在煙葉A、C中的降解效率最低,小于10%。

表2 發(fā)酵前、后每克煙葉中大分子化合物的含量變化Table 2 The content change of macromolecular compounds in each gram of tobacco leaves before and after fermentation %

由表3可以看出:經(jīng)過菌株發(fā)酵后,煙葉中的總糖含量增加。菌株yc10發(fā)酵后煙葉A、B、C、D中總糖含量比發(fā)酵前分別增加20.29%、9.84%、19.89%、11.38%。

表3 發(fā)酵前、后每克煙葉中總糖含量的變化Table 3 Total sugar content change in each gram tobacco leaves before and after fermentation %

2.5 煙葉中香氣成分的測(cè)定

由表4可見:煙葉A經(jīng)過菌株yc10發(fā)酵后,酮類物質(zhì)、酸類物質(zhì)、酯類香氣成分和雜環(huán)類化合物含量均比發(fā)酵前增加。煙葉中酸類物質(zhì)中,乙酸及3-甲基丁酸含量增加較多;葉綠醇含量明顯增加,比發(fā)酵前增加了21.53%。在煙葉A中還發(fā)現(xiàn)了3種醛類物質(zhì),雖然種類不多,但是經(jīng)過yc10菌株發(fā)酵后醛類物質(zhì)的總量增加了0.45%。

表4 發(fā)酵前、后煙葉中香氣成分含量變化Table 4 Aroma components contents change in tobacco leaves before and after fermentation

3 討論與結(jié)論

研究表明,改善和提高煙葉質(zhì)量的主要措施是將煙葉中對(duì)煙葉品質(zhì)有顯著影響的大分子物質(zhì)降解或通過發(fā)酵將它們轉(zhuǎn)化成小分子的香氣物質(zhì)[21-23]。煙草行業(yè)常用的發(fā)酵方法一般分為自然發(fā)酵和人工發(fā)酵兩類。生物發(fā)酵相比于自然發(fā)酵和人工發(fā)酵來說有諸多的優(yōu)點(diǎn),比如發(fā)酵周期短,不受天氣情況的限制,占地面積小,同時(shí)生物發(fā)酵會(huì)增加煙葉中香氣成分的含量,彌補(bǔ)了人工發(fā)酵之后煙葉香氣不足的缺點(diǎn)。本研究從煙葉表面篩選出1株具有多重降解效果的假單胞桿菌屬細(xì)菌菌株P(guān)seudomonasgessardiiyc10,可以同時(shí)降解煙葉中的淀粉、纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和果膠,有效降解煙葉中的大分子化合物和有害前體物質(zhì),減少煙草燃吸過程中產(chǎn)生的有毒性和刺激性氣體,增加煙葉中的香氣成分,改善了煙葉品質(zhì)。

生物發(fā)酵的基本原理是用微生物來降解煙葉中的大分子物質(zhì),如淀粉、蛋白質(zhì)、果膠等,減少有害物質(zhì)(如煙堿、焦油等)的產(chǎn)生,提高煙葉中的小分子物質(zhì),增加香氣成分的含量,提高煙葉的品質(zhì)[24-25]。微生物發(fā)酵效率明顯高于傳統(tǒng)的煙葉自然或人工發(fā)酵,在優(yōu)化條件下更能大大縮短發(fā)酵時(shí)間。利用微生物發(fā)酵技術(shù)誘發(fā)煙葉內(nèi)有機(jī)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,促進(jìn)煙葉香味物質(zhì)的積累,對(duì)提高煙葉內(nèi)香味物質(zhì)含量,改善陳化煙葉香吃味具有重要意義。

本研究中,經(jīng)過對(duì)煙葉樣品香氣成分的分析,發(fā)現(xiàn)菌株發(fā)酵后煙葉A中的酮類、酯類、醇類等香氣物質(zhì)的含量均有不同程度增加,這些物質(zhì)都是煙葉中重要的致香物質(zhì),與煙草的香氣與品質(zhì)密切相關(guān)。用菌株yc10發(fā)酵后,含量增加的酮類物質(zhì)中,紫羅蘭酮和大馬酮是玫瑰油的主要香氣化合物,它們賦予煙氣花香和木香的吸味品質(zhì);β-大馬酮可以賦予煙葉木香、花香、果香和甜香,特別是賦予充分成熟的煙草香味特征,同時(shí)茄酮、巨豆三烯酮主要形成了烤煙精油的香氣[26]。含量增加的揮發(fā)性脂肪酸(C10以下)中,乙酸、丙酸及丁酸等對(duì)煙葉的香味有顯著影響,可以調(diào)節(jié)煙草的酸堿度,使吸味醇和,增加煙氣濃度,從而在煙氣中起到平衡作用[27]。煙葉中的酯類化合物對(duì)香氣成分的影響和貢獻(xiàn)很大,許多酯類化合物對(duì)煙氣香味有較好的影響,具有明顯的香味特征[28],煙葉A經(jīng)過發(fā)酵后揮發(fā)性內(nèi)酯的含量增加,增加煙氣的豐富性,對(duì)煙葉香氣也有顯著影響。煙草中分離出來的雜環(huán)類化合物、醇類成分及醛類成分均為重要的致香物質(zhì),煙葉A發(fā)酵后含量增加的葉綠醇具有花香和香脂香氣,3-甲基-1-苯基吡啶、苯甲醛,苯乙醛的含量也有所增加,這些化合物可以賦予煙葉濃郁的烤香,對(duì)增強(qiáng)和改進(jìn)煙葉香味具有明顯作用[29-30]。

此外,由于微生物使煙葉中的淀粉、纖維素等大分子化合物降解為單糖等小分子物質(zhì),使煙葉A中的總糖含量增加,煙葉中的糖在熱分解時(shí)會(huì)使煙氣pH值呈酸性,中和煙氣中煙堿的作用,降低煙氣的刺激性。

本研究將菌株yc10的發(fā)酵液噴灑在煙葉表面,可有效降低發(fā)酵樣中的淀粉、纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和果膠含量,發(fā)酵后煙葉中總糖含量增加,酮類、酸類、酯類、雜環(huán)類、醇類和醛類物質(zhì)的含量也增加,表明微生物作用于煙葉之后對(duì)煙葉的香氣品質(zhì)有所改善。但不足的是,本研究是在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)微生物降解煙葉中淀粉、纖維素、木質(zhì)素、果膠和蛋白質(zhì)等大分子化合物的作用效果進(jìn)行的初步探索,作用條件及應(yīng)用范圍與實(shí)際生產(chǎn)還存在差異,還需要進(jìn)一步研究。