司超娜,張嘉欣,陳發(fā)棣,蔣甲福

(南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室/農業(yè)農村部景觀農業(yè)重點實驗室/園藝學院,江蘇 南京 210095)

菊花(Chrysanthemummorifolium)是我國十大傳統(tǒng)名花之一,在我國園藝產業(yè)中具有重要的經濟價值[1]。作為觀賞花卉,菊花花期直接影響其觀賞價值和經濟價值。多數菊花品種是短日照植物,自然花期集中于11月前后[2-3],傳統(tǒng)的遮光和補光既耗費大量的人力物力,又難以滿足周年供應的市場需求,因此對菊花花期調控進行研究以期提高菊花的適用性和觀賞價值意義重大。

CDK類細胞周期蛋白依賴性激酶(CAK)屬于保守的真核絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶超家族[4]?；谥参镏芷诘鞍谆蛳到y(tǒng)可將植物CDK相關基因分為5類:CDKA、CDKB、CDKC、CDKD和CDKE,其中CDKD類包括后生動物CDK7的植物同源物,屬于CDK激活激酶,如cdc2蛋白激酶[5]。真核生物中有絲分裂的發(fā)生都受p34cdc2/CDC28蛋白激酶的調節(jié)[6]。水稻中的C型CDK基因OsCDKC;1與OsCYCT相互作用,參與鹽和ABA信號通路,在成熟的葉片和穗中檢測到較高的轉錄本,表明CDK類基因在水稻的葉片和果實發(fā)育的后期階段可能發(fā)揮重要功能[7]。擬南芥中存在與脊椎動物型CAK相似的基因,1個AtCDKF(CDKF;1)和3個AtCDKD(CDKD;1—CDKD;3)。研究發(fā)現,cdkd;1-1cdkd;3-1雙突變體大多數花粉粒在花粉有絲分裂Ⅰ和Ⅱ期中有缺陷,產生缺乏受精能力的單細胞或兩細胞花粉粒[8],表明CDK類蛋白激酶對于植物花發(fā)育具有調控作用。CDK類細胞周期蛋白依賴性激酶參與植物細胞生物學的很多方面,包括基因轉錄、激素處理響應和細胞周期節(jié)律調控等[4],進而控制整個植物發(fā)育過程中的細胞周期進程。本試驗在菊花‘神馬’中克隆了cdc2相關的激酶蛋白基因CmCDKL9,對其進行生物信息學分析,研究其在菊花不同組織部位的表達以及在不同光周期條件下的表達變化,旨在為進一步研究CmCDKL9基因在菊花中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型菊花品種‘神馬’由南京農業(yè)大學中國菊花種質資源保存中心提供。采集生長狀況良好的野生型‘神馬’插穗于穴盤中扦插生根,待生長至6～8片展開葉后選取長勢一致的植株種植于一次性塑料杯中,緩苗后在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周,培養(yǎng)條件設置為:光照/黑暗時間為16 h/8 h,溫度為22 ℃,相對濕度為65%～70%,生長基質為蛭石和營養(yǎng)土(體積比為3∶1)。

1.2 植株處理方法

1.2.1 組織定量分析取營養(yǎng)生長時期和花芽分化時期8～10片展開葉野生型‘神馬’的根、莖、老葉(從上至下第5片葉)、幼葉(即頂芽)/花蕾樣品,每個樣品3個生物學重復。液氮速凍后提取RNA并反轉錄。

1.2.2 長日照和短日照條件下表達模式分析選取上述光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的6～8片展開葉、長勢一致的野生型‘神馬’植株,分別置于長、短日照光培養(yǎng)箱中,長日照處理光照/黑暗時間為16 h/8 h,短日照處理光照/黑暗時間為8 h/16 h,生長溫度22 ℃,預培養(yǎng)3 d后開始取樣。每4 h取樣1次,取樣部位為從上到下第3片完全展開葉,每個時間點取樣設3個生物學重復,液氮速凍后提取樣品的RNA并反轉錄。取樣時間為 2個生物鐘周期[9],即48 h。

1.3 總RNA的提取與cDNA的檢測

以菊花‘神馬’葉片為材料,采用RNA提取試劑盒(北京華越洋生物科技有限公司)提取RNA,用 10 g·L-1瓊脂凝膠檢測。取1 000 ng RNA利用PrimeScriptTMRT reagent(with gDNA Eraser)反轉錄試劑盒(TaKaRa)去除基因組獲得cDNA,并用內參基因CmEF1α作為引物(EF1α-F:TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG,EF1α-R:CCATTCAAGCGACAGACTCA)檢測cDNA的質量。

1.4 CmCDKL9基因的克隆

根據菊花‘優(yōu)香’轉錄組庫數據(NCBI登錄號:SRP076366),以‘神馬’葉片cDNA為模板,使用Primer Premier 5.0軟件設計該基因全長引物(CmCDKL9-F:CAATGGGTTGTGTACTCGGTAAAC,CmCDKL9-R:TCCTATCTACCTTCTGCTGCCAA)。Phusion高保真DNA聚合酶(TaKaRa)進行全長擴增,PCR程序為:98 ℃ 30 s;98 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,共35個循環(huán);72 ℃ 10 min。用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳進行擴增產物檢測。確認條帶正確后,切膠回收并用Axygen Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0純化,使用pEASY-Blunt Simple作為克隆載體進行連接,并采用熱激法轉化大腸桿菌DH5α;挑選陽性菌落,凝膠電泳檢測后,選取條帶大小正確的菌液送思普金生物科技有限公司進行測序。保存菌液進行下一步試驗。

1.5 系統(tǒng)進化樹構建和序列分析

使用NCBI的BLASTx程序,比對菊花CmCDKL9氨基酸序列,篩選多個CDK同源蛋白。利用DNAMAN 6.0軟件的多重比對功能,對CmCDKL9蛋白的氨基酸序列與其他7個植物物種進行蛋白序列比對。采用MEGA 7.0軟件[10]用鄰接法(neighbor-joining)對多物種CDK蛋白序列進行分析,構建進化樹。使用ExPASy ProtParam tool在線工具對蛋白質相對分子質量、等電點、分子式等理化性質進行分析。分別使用TMHMM和signal IP對蛋白的跨膜區(qū)以及信號肽進行預測。使用SOPMA和Phyre 2對蛋白的二級結構和三級結構進行預測。在甘野菊的基因組公共數據庫(http://mum-garden.kazusa.or.jp/cgi-bin/blast.cgi,Cse_sc000677.1)查找CmCDKL9的啟動子序列,使用Plantcare軟件對CmCDKL9基因啟動子序列進行分析。

1.6 CmCDKL9基因植物表達載體構建與蛋白亞細胞定位分析

將pORE-R4空載體和CmCDKL9ORF產物用XhoⅠ和SalⅠ(TaKaRa)進行雙酶切,構建pORE-R4-CmCDKL9載體,用于亞細胞定位。將上述的pORE-R4-CmCDKL9質粒載體利用電轉法轉入農桿菌感受態(tài)GV3101,利用基因克隆的正、反向引物(CmCDKL9-F/R)檢測得到轉化成功、含有pORE-R4-CmCDKL9質粒載體的農桿菌。將pORE-R4-CmCDKL9、P19、帶有融合紅色熒光蛋白的OsD53-mCherry作為核定位信號的農桿菌菌液混合,暗培養(yǎng)3 h后注射長勢好、葉齡為3周左右的本氏煙草葉片,暗培養(yǎng)16 h后,轉至光照/黑暗時間為16 h/8 h條件下培養(yǎng)48 h,在激光共聚焦顯微鏡下觀察核定位信號以及綠色熒光信號。

1.7 CmCDKL9基因的表達量測定及分析

根據克隆的CmCDKL9基因序列全長,利用Primer Premier 5.0設計熒光定量PCR引物(QCmCDKL9-F:AGAACAAGAAAGAACCATCACG,QCmCDKL9-R:ACCTTCTGCTGCCAAAAACCTC),以野生型菊花‘神馬’cDNA為模板,進行PCR特異性片段擴增。PCR程序為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35個循環(huán);72 ℃ 10 min。通過20 g·L-1瓊脂糖凝膠檢測擴增產物是否為單一清晰條帶,將擴增產物送公司測序比對,確定定量引物可用。使用Real Time PCR熒光定量儀(Eppendorf),定量加樣體系為20 μL:10 μL SYBRPremixExTaqⅡ,5 μL cDNA模板(1 000 ng反轉錄后稀釋10倍),正、反向引物各1 μL(100 μmol·L-1),3 μL ddH2O。反應程序為:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s,循環(huán)數為 40個?；虿町惐磉_以CmEF1α基因作為內參基因。采用2-ΔΔCT法[11]計算基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 CmCDKL9基因的克隆及編碼蛋白的氨基酸序列分析

由圖1可見:PCR擴增獲得菊花‘神馬’CDKL9基因全長序列,根據在菊花‘優(yōu)香’轉錄組數據庫中的描述,將其命名為CmCDKL9。該基因長度為1 680 bp,包含一個 1 671 bp開放閱讀框,編碼556個氨基酸(圖2)。NCBI保守結構域預測顯示,該蛋白具有保守的STKc-CDK9-like 基序,保守域位于第90～374個氨基酸處,屬于PKC-like超級家族成員。在線軟件ExPASy ProtParam tool分析表明,CmCDKL9蛋白相對分子質量為62.3×103,理論等電點(pI)為9.60。該蛋白中絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)分別占全部氨基酸的9.20%和4.50%,占比較高,這與CmCDKL9是一種絲氨酸和蘇氨酸類型的磷酸化蛋白激酶相符。該蛋白脂肪指數為78.04,親水性平均指數為 -0.546,預測其為親水性蛋白。

圖1 菊花‘神馬’CmCDKL9的克隆Fig.1 Gene cloning of CmCDKL9 from wild-typeChrysanthemum morifolium ‘Jinba’M. DL 2000 DNA marker;1,2. CmCDKL9.

圖2 CmCDKL9基因所編碼的氨基酸序列Fig.2 CmCDKL9 gene encoded amino acid sequenceSTKc-CDK9-like保守域基序由下劃線標出。STKc-CDK9-like conservative domain sequence motif is underlined.

利用 SOPMA網站對 CmCDKL9蛋白的二級結構進行分析,其蛋白主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈構成,分別占57.01%、32.01%和10.97%(圖3)。

圖3 CmCDKL9蛋白二級結構預測Fig.3 Secondary structure prediction of CmCDKL9 protein 紅色代表延伸鏈,藍色代表α-螺旋,紫色代表無規(guī)則卷曲,綠色代表β-轉角。The red line represents the extension chain,the blue line represents the α-helix,the purple line represents the random coil,and the green line represents the β-sheet.

2.2 CmCDKL9基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析及同源序列比對

CmCDKL9與其他10個物種的CDK蛋白進化樹分析結果(圖4)表明,CmCDKL9與黃花蒿和除蟲菊的CDK蛋白親緣關系最近,向日葵次之,而與林煙草的親緣關系較遠,表明CDK蛋白在菊科植物中進化較為保守。

圖4 不同物種間CDKL9蛋白的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of CDKL9 protein in different species

氨基酸序列比對結果(圖5)顯示,CmCDKL9與林煙草、茶樹、除蟲菊、向日葵和黃花蒿的CDKL9氨基酸序列相似性分別為65.72%、66.72%、72.13%、76.21%和90.35%,表明從菊花中克隆得到的CmCDKL9基因所編碼的蛋白與其他物種的CDKL9蛋白具有較高的保守性。另外,不同物種間該蛋白的中間區(qū)域相對保守,N端和C端差異較大,這與使用NCBI預測的CmCDKL9蛋白的保守域位于第90～374個氨基酸區(qū)段是相符的。

圖5 CmCDKL9蛋白與其他物種的氨基酸序列比對Fig.5 The amino acid sequence comparison of CmCDKL9 protein with those from other species保守域由紅框標注。Conservative fields are marked by red boxes.

2.3 CmCDKL9蛋白的跨膜區(qū)和亞細胞定位分析

對CmCDKL9蛋白進行TMHMM跨膜區(qū)預測,結果表明該蛋白沒有信號肽和跨膜域,預計跨膜螺旋數為0,跨膜螺旋中預期的氨基酸數為0,N端在膜的細胞質側的總概率為0.451%,即不屬于分泌蛋白。亞細胞定位結果(圖6)發(fā)現,CmCDKL9亞細胞定位于細胞膜與細胞核,與陽性空載體對照沒有顯著的差別。

圖6 35S∷R4-GFP-CmCDKL9煙草亞細胞定位Fig.6 Subcellular localization of 35S∷R4-GFP-CmCDKL9 in tobacco

2.4 菊花CmCDKL9基因表達模式分析

2.4.1 組織特異性表達分析由圖7可見:在營養(yǎng)生長時期和花芽分化時期,CmCDKL9在被檢測的各個組織中均有表達。在營養(yǎng)生長時期,CmCDKL9基因表達量由高到低的組織依次為幼葉、莖、根、老葉,在幼葉中的表達量最高,約為莖和根的1.5倍,約為老葉的3.5倍。在花芽分化時期,CmCDKL9基因表達量由高到低的組織依次為花蕾、莖、老葉、根,在花蕾中的表達量最高,約為莖、老葉和根的2.7、4.5和23.6倍。表明CmCDKL9基因對菊花的花芽分化和成花可能發(fā)揮一定的調控作用。

圖7 菊花CmCDKL9在營養(yǎng)生長時期和花芽分化時期不同組織的表達量Fig.7 The expression level of CmCDKL9 in different tissues of C.morifolium during the vegetative growth period and flower bud differentiation period

2.4.2CmCDKL9基因的啟動子序列分析對CmCDKL9基因的啟動子序列(5.5 kb)分析發(fā)現,其含有赤霉素、茉莉酸甲酯、低溫響應元件和典型的CAAT-box和TATA-box元件,并含有G-box、LAMP-element、GT1-motif、Box 4等多種光響應元件和參與光響應的順式作用元件(圖8)。

圖8 CmCDKL9基因啟動子所含光響應順式元件模型圖Fig.8 Model diagram of CmCDKL9 gene promoter containing photoresponse cis-element TCT-motif:光響應元件的一部分;G-box:參與光響應的順式調控元件;LAMP-element:光響應元件的一部分;GT1-motif:光響應元件;Box 4:參與光反應的保守DNA模塊的一部分;AE-box:光響應部分模塊。TCT-motif:Part of a light responsive element;G-box:cis-acting regulatory element involved in light responsiveness;LAMP-element:Part of a light responsive element;GT1-motif:Light responsive element;Box 4:Part of a conserved DNA module involved in light responsive;AE-box:Part of a module for light response.

2.4.3 不同光周期下的表達量變化定量結果(圖9)顯示,短日照條件下,CmCDKL9基因表達量不具有節(jié)律變化;在長日照條件下,在24 h過程中,CmCDKL9的表達量在4和20 h達到峰值,在12和24 h達到谷值,隨著光照和黑暗的交替其表達量呈現有規(guī)律的上升和回歸即響應光周期變化,推測其可能在長日照抑制菊花開花過程中發(fā)揮一定的作用。

圖9 CmCDKL9在長日照(A)和短日照(B)條件下的表達模式分析Fig.9 Expreesion profiles of CmCDKL9 under long day(A)and short day(B)conditions白框代表光照時間,黑框代表黑暗時間。White box represents illumination time,black box represents darkness time.

3 討論

已知模式植物開花主要有6種調控路徑,包括光周期路徑、春化路徑、自主路徑、年齡路徑、赤霉素路徑和溫度路徑[12]。根據開花對日照時長的需求將其分為短日照植物、長日照植物和日中性植物[13],它們可以敏銳感知晝夜交替和光照變化來調控花芽分化[14-15]。菊花屬于典型的短日照開花品種,光周期調控路徑作為菊花花期研究的重要路徑[16],分離鑒定光周期路徑的關鍵因子有利于加快菊花育種進程。

在真核生物中,細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)最初被發(fā)現參與細胞周期調控,隨著高通量測序技術的發(fā)展,蛋白激酶類的基因及其功能不斷被發(fā)掘。在水稻中,已報道有2種cdc2蛋白激酶Oscdc2-1和Oscdc2-2,水稻的R2基因與cdc2激活激酶(CAK)蛋白激酶家族具有55%的序列同一性,該家族可磷酸化并激活動物和酵母中的cdc2蛋白激酶[17]。OsKRP3作為一種CDK蛋白激酶抑制劑(CKI)參與水稻合胞胚乳的細胞周期調控[18]。在深水水稻節(jié)間快速生長的誘導試驗中發(fā)現,增加的p34cdc2/CDC28蛋白激酶活性可以促進赤霉素(GA)誘導深水水稻的節(jié)間快速生長[19]。Joubès等[4]對番茄幼果cDNA文庫進行篩選,獲得CDK蛋白激酶家族3個成員全長cDNA,并命名為CDKC;1、CDKB1;1和CDKB2:1,進一步發(fā)現其可參與番茄營養(yǎng)器官和果實發(fā)育過程中的組織分裂。在擬南芥中,酪蛋白激酶CKL家族參與植物鐘中TTFL轉錄阻遏物的翻譯后修飾,敲低CKL編碼基因可延長其晝夜節(jié)律周期[20]。也有研究發(fā)現擬南芥CDK9樣蛋白CDKC;1和CDKC;2及其相互作用的細胞周期蛋白T伴侶CYCT1;4和CYCT1;5對于花椰菜花葉病(CaMV)基因的轉錄激活和植物生長發(fā)育方面起著關鍵的調控作用,CDKC;1/CDKC;2或CYCT1;4/CYCT1;5的功能喪失會導致擬南芥毛狀體發(fā)育和開花延遲[21]。對CDK類蛋白激酶功能深入的研究為菊花CmCDKL9在蛋白磷酸化、激素處理響應和生物鐘調控開花發(fā)育方面提供了借鑒和參考。

本研究從‘神馬’菊花中克隆獲得編碼CDK類蛋白激酶的基因CmCDKL9全長序列,其與同為菊科的黃花蒿中的CDKL9基因親緣關系最近,序列相似性為90.35%,此外,它還與除蟲菊、向日葵和薇甘菊等菊科物種的CDKL9基因親緣關系很近,表明CDKL9基因在菊科植物中進化保守。煙草亞細胞定位試驗發(fā)現,CmCDKL9定位于細胞膜和細胞核,表明其可能和某些轉錄因子協(xié)同發(fā)揮調控功能。組織特異性表達分析表明,CmCDKL9基因分別在菊花的營養(yǎng)生長時期和花芽分化時期的幼葉和花蕾中表達量最高,表明該基因可能參與光信號的接收和傳遞,在成花素運輸和開花誘導過程中發(fā)揮一定作用[22]。本研究通過對不同光周期處理下CmCDKL9的表達模式分析發(fā)現,該基因響應長日照變化,暗示其可能參與‘神馬’菊花的光周期路徑調控,這與CmCDKL9基因含有G-box、AE-box、GT1-motif等多個光響應元件互相印證。在擬南芥中,CO對下游靶基因的調控依賴日照長度的變化[23]。在長日照條件下,CO蛋白積累后通過直接結合AtFT的啟動子促進葉片韌皮部中AtFT的表達[24-25];積累的FT蛋白向植物的形態(tài)學上端運輸,在頂端分生組織中與TCP、bZIP類轉錄因子FD蛋白相互作用形成復合體,被招募至AtAP1的啟動子區(qū),協(xié)同調控植物的開花進程[26]。在短日照條件下,MYC3與赤霉素路徑的DELLA蛋白互作,與低富集的CO蛋白競爭結合AtFT啟動子,抑制FT轉錄并導致擬南芥晚開花[15]。另外,CDK蛋白具有保守的Ser/Thr蛋白激酶催化域[27],可與14-3-3蛋白相互作用形成復合物,而14-3-3蛋白也可作為其底物發(fā)生磷酸化以調控CDK蛋白的活性[28-29]。擬南芥中的磷脂酰乙醇胺結合蛋白開花位點D(AtFD)可與14-3-3蛋白形成復合體,與開花位點T(AtFT)相互作用激活花分生組織基因AtAP1進而促進開花[30]。由此推測CmCDKL9可能與光周期路徑的某些成花因子相互作用,并可能發(fā)生磷酸化作用以調控開花。

關于CmCDKL9基因對菊花的開花是否具有調控功能,其作為一個絲氨酸/蘇氨酸類型的蛋白激酶,發(fā)揮磷酸化作用的效果和分子機制如何,都有待于后續(xù)的研究驗證?？傊?本研究為挖掘篩選菊花光周期路徑關鍵調控因子和下一步的基因功能鑒定奠定了基礎。