張亮,潘紅梅,郭宗義

(重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 402460)

在妊娠的大部分時間里,子宮平滑肌在孕酮的作用下,保持松弛平順的狀態(tài),也會通過細(xì)胞肥大和體積擴張來適應(yīng)胎兒的生長發(fā)育。分娩過程則會出現(xiàn)子宮肌層細(xì)胞有力且有節(jié)律性收縮,子宮肌層這種激活狀態(tài)的轉(zhuǎn)換和腹部肌肉收縮的同步是母體啟動分娩的關(guān)鍵。然而不同物種在整個懷孕期間子宮肌層的靜息狀態(tài)受胎盤或卵巢黃體分泌的孕酮(progesterone,P4)控制的機制卻不同。在人類中主要由單個基因產(chǎn)生的不同轉(zhuǎn)錄本、孕激素受體(progesterone receptor,PR)PR-A(94 k)和PR-B(114 k)異構(gòu)體來介導(dǎo)P4阻斷肌層收縮的作用。盡管PR-A和PR-B均可與DNA中的孕酮反應(yīng)元件(progesterone response element,PRE)結(jié)合,但PR-A包含PR-B中存在的3個轉(zhuǎn)錄激活域中的2個,因此轉(zhuǎn)錄活性較低。在體外培養(yǎng)的人子宮肌細(xì)胞中PR-A抑制PR-B轉(zhuǎn)錄活性[1],說明PR-A對子宮肌層中的PR-B有潛在拮抗作用。此外,在分娩的女性子宮肌層中PR-A與PR-B的mRNA[2]和蛋白質(zhì)[1]的比例顯著高于足月不分娩女性,說明 PR-A 和PR-B在妊娠期間在人子宮肌層中存在不同的調(diào)控模式[3-4]。

嚙齒動物和大多數(shù)哺乳動物母體在整個懷孕期間P4水平仍然維持高水平,并在分娩前急劇下降,然而人和豚鼠的血漿中P4濃度以及肌層中PR表達在分娩前期卻沒有出現(xiàn)下降[5]。此外在缺乏Ⅰ型5α還原酶或在子宮內(nèi)膜中表達20α羥類固醇脫氫酶(20α-HSD)[6]的小鼠會出現(xiàn)分娩延遲,可見子宮頸和子宮肌層內(nèi)P4代謝為無生物活性的產(chǎn)物對于其正常的分娩啟動至關(guān)重要。由此可見胎盤哺乳動物的分娩都是由一系列保守的分子事件所引發(fā)的,而引起分娩的關(guān)鍵就是PR維持子宮靜息能力的解除或阻斷。本文回顧了妊娠期間P4/PR通過不同途徑維持子宮肌層靜息的主要機制以及分析引起分娩前期的PR性阻斷的主要因素,為進一步了解哺乳動物分娩啟動的分子機制和在畜牧生產(chǎn)中更好地控制母畜分娩提供有益思路。

1 雌性動物分娩與子宮肌層炎性反應(yīng)或母體炎癥負(fù)擔(dān)增加有關(guān)

早產(chǎn)和足月分娩是由炎癥反應(yīng)增強、羊水中促炎細(xì)胞因子水平升高、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(M)侵入胎膜、子宮頸以及子宮肌層[7]引起的(圖1)。母體外在的(如宮內(nèi)壓力、子宮內(nèi)感染)和內(nèi)在的(例如子宮擴張、胎兒成熟、胎膜老化)各種因素都能引起子宮肌層炎性反應(yīng)[8-10]。甚至有學(xué)者認(rèn)為哺乳動物的分娩本質(zhì)上是炎癥反應(yīng)的過程,是源發(fā)于子宮肌層、子宮頸和蛻膜內(nèi)的無菌組織炎癥的繼發(fā)反應(yīng)[11-12]。多數(shù)早產(chǎn)與子宮內(nèi)、生殖道感染以及細(xì)菌性陰道炎有密切關(guān)系[13-15]。對恒河猴的研究表明,母體妊娠組織中的炎癥反應(yīng)先于分娩發(fā)生,并且對懷孕的恒河猴和小鼠子宮內(nèi)實施促炎性刺激都將引發(fā)早產(chǎn)[16-17]。此外,隨著遷移至子宮肌層的免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子引起NF-κB和其他炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如激活子蛋白1(activator protein 1,AP-1)等的激活[15,19-21],這些活化的轉(zhuǎn)錄因子促進子宮肌層促炎因子,如白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-8和收縮相關(guān)蛋白(contraction-associated protein,CAP)基因的表達,如連接蛋白43(connexin 43,CX43)、催產(chǎn)素受體(oxytocin receptor,OXTR)和環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2),這一系列炎癥相關(guān)的分子事件都與分娩的發(fā)生密切相關(guān)[22]。

圖1 由孕酮功能性阻斷介導(dǎo)的雌性動物足月分娩啟動與炎癥反應(yīng)有關(guān)[18]Fig.1 The initiation of term parturition induced by P4/PR functional blockade is associated with an inflammatory response[18] PR:孕激素受體Progesterence receptor;NF-κB:核因子κB Nuclear factor kappa-B;AP-1:激活子蛋白1 Activator protein 1;P38MAPK:p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路p38 mitogen-activated protein kinase signal pathway;ZEB1:E 盒結(jié)合鋅指蛋白Zinc finger E-box-binding protein 1;CX43:連接蛋白43 Connexin 43;OXTR:催產(chǎn)素受體Oxytocin receptor;COX-2:環(huán)氧化酶2 Cyclooxygenase 2;20α-HSD:20α羥類固醇脫氫酶20α-hydroxysteroid dehydrogenase;STAT5b:信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5b Signal transducer and activator of transcription protein 5b.箭頭表示該物質(zhì)促進或引起了后面生理反應(yīng)或化學(xué)作用;↗表示該基因表達量增多或該蛋白功能增強;↘表示該基因表達量減少或該蛋白功能缺失。下同。Arrow indicates that the substance promotes or causes subsequent physiological or chemical reactions;↗indicates that the gene/protein up-expressed;↘indicates that the gene/protein down-expressed. The same as follows.

2 P4/PR通過多種途徑來保持子宮肌層靜息狀態(tài)

如前所述母體的炎癥反應(yīng)是引起子宮肌層收縮并導(dǎo)致分娩的重要因素,而在妊娠期間母體主要是由P4/PR通過多種途徑來維持肌層靜止。包括:1)誘導(dǎo)促炎性轉(zhuǎn)錄因子激活抑制劑的表達,如核因子κB抑制子(inhibitor a of NF-κB,IκBα)和絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1,MKP-1),降低NF-κB的活性和活化蛋白1(AP-1)的轉(zhuǎn)錄活性;2)通過相互作用和募集共抑制子抑制炎癥前轉(zhuǎn)錄因子活性(如NF-κB)和CAP基因表達;3)通過誘導(dǎo)CAP基因轉(zhuǎn)錄阻遏物E 盒結(jié)合鋅指蛋白1/2(zinc finger E-box-binding protein,ZEB1/2)和STAT5b的表達,維持肌層靜止;4)誘導(dǎo)半胱天冬酶活化,降解CAP蛋白維持肌層靜息狀態(tài)(圖2)。

圖2 雌性動物妊娠期間P4/PR維持子宮肌層靜止的機制[18]Fig.2 Mechanisms for P4/PR maintenance of myometrial quiescence during pregnancy[18] IκBα:核因子κB抑制子Inhibitor of NF-κB;MKP-1:絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1 Mitogen-activated protein kinase phosphatase-1;p65/p50:NF-κB轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白p65和p50形成的異源二聚體NF-kappaB subunits p65 and p50. 下同。The same as follows.

2.1 P4/PR通過誘導(dǎo)促炎轉(zhuǎn)錄因子激活抑制劑(IκBα、MKP-1)的表達來抑制NF-κB和AP-1的活化

大量研究[23-25]表明P4/PR通過阻止炎癥的作用維持子宮肌層的靜止(圖2)。在培養(yǎng)的人永生化子宮平滑肌(hTERT-HM)細(xì)胞中,P4/PR通過拮抗NF-κB的活化并阻止COX-2[24,26]、促炎性細(xì)胞因子和CAP基因的誘導(dǎo)而發(fā)揮抗炎作用。使用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)研究后發(fā)現(xiàn),用P4處理hTERT-HM細(xì)胞可阻止白介素1(IL-1)誘導(dǎo)的內(nèi)源性NF-κB p65與COX-2和IL-8啟動子上反應(yīng)元件的結(jié)合[4,23]。P4介導(dǎo)的促炎性和CAP基因轉(zhuǎn)錄的抑制可能是由于PR與p65結(jié)合對NF-κB DNA結(jié)合的抑制和CAP基因轉(zhuǎn)錄活性的降低所引起的。

P4/PR還可以通過增加IκBα的表達來阻斷NF-κB的活化和炎性反應(yīng),IκBα隔離細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB并阻止其活化[23](圖2)。經(jīng)P4處理的hTERT-HM細(xì)胞可快速誘導(dǎo)IκBα的表達,并抑制由IL-1β誘導(dǎo)的COX-2表達[23]。P4/PR進一步的抗炎作用主要是通過有絲分裂原活化蛋白激酶1(MAPK-1)抑制劑雙特異性磷酸酶1(dual-specificity phosphatase 1,DUSP1)的上調(diào)來介導(dǎo)[27],即通過抑制MAPK信號通路來抑制NF-κB和AP-1的活化[28]。

2.2 P4/PR通過募集共抑制因子抑制炎癥前轉(zhuǎn)錄因子活性和CAP基因表達

為了明確P4抑制子宮內(nèi)膜促炎性作用和CAP基因表達的機制,Chen等[4]分析野生型孕酮受體(PRWT)和各種突變體孕酮受體與孕酮結(jié)合后,在hTERT-HM細(xì)胞中抑制相關(guān)基因能力的表達。這些過程包括一個SUMO化突變、一個防止PR二聚化的鉸鏈結(jié)構(gòu)域突變,以及DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)中3個氨基酸的突變。其中PR-DBD的突變可以阻止P4對前炎癥基因的抑制。因此,與表達PRWT的細(xì)胞相比,在穩(wěn)定表達PR-A或PR-B DNA結(jié)合域突變體(PRmDBD)的細(xì)胞中,P4介導(dǎo)的反式抑制顯著降低。對hTERT-HM細(xì)胞的免疫共沉淀(ChIP)分析顯示,P4/PRWT抑制活性在COX-2和IL-8的啟動子上與P4誘導(dǎo)PR募集和抑制NF-κB p65以及RNA Pol Ⅱ募集到的NF-κB上反應(yīng)元件有關(guān)。重要的是在P4處理后,PRWT與PRmDBD均募集至COX-2和IL-8啟動子。這表明P4/PR對COX-2和IL-8表達的抑制作用不是通過直接結(jié)合DNA來介導(dǎo)的,而可能是通過與NF-κB形成共抑制子來介導(dǎo)的。因此推測核蛋白與PR-DBD相互作用可能介導(dǎo)P4/PR的轉(zhuǎn)錄抑制。Chen等[4]對使用ChIP獲取的蛋白進行質(zhì)譜分析,鑒定了與PRWT相互作用較強而與PR-DBD突變體相互作用較弱的蛋白質(zhì),如含2B的GATA鋅指結(jié)構(gòu)域(GATAD2B)的轉(zhuǎn)錄阻遏物,它與PR-DBD的相互作用是P4/PR抑制前炎癥反應(yīng)和CAP基因表達必需的。經(jīng)過P4處理后PRWT hTERT-HM細(xì)胞增加內(nèi)源性GATAD2B向COX-2和IL-8啟動子募集的效率,用siRNA敲除GATAD2B則顯著降低P4-PRWT對COX-2和 IL-8 的轉(zhuǎn)錄抑制。值得注意的是,在分娩過程中,妊娠母鼠和人子宮肌層GATAD2B的表達顯著下降?？傊瓽ATAD2B在妊娠期間可作為P4/PR抑制促炎反應(yīng)和CAP基因表達的新介體。因此,短期內(nèi)GATAD2B表達下降可能導(dǎo)致PR功能喪失,從而導(dǎo)致分娩。

妊娠子宮肌層中的前炎癥刺激對CX43表達的誘導(dǎo)部分是由AP1家族成員(包括Fos/Jun異二聚體或Jun/Jun同型二聚體)的轉(zhuǎn)錄活性增加介導(dǎo)的(圖3)。Mitchell等[29]發(fā)現(xiàn)與相對較弱的Jun/Jun同型二聚體相比,Fos/Jun異二聚體是CX43表達的強誘導(dǎo)劑。Nadeem等[30]發(fā)現(xiàn)P4與PR-B結(jié)合后,在CX43啟動子上募集無活性的Jun/Jun同型二聚體以及p54nrb/Sin3A/HDAC形成共抑制子來抑制CX43表達。有研究表明子宮肌層中20α-羥類固醇脫氫酶(20α-HSD)會增加P4的代謝[31],并且由炎癥引起的PR-A/PR-B比值增加[2,32-33]而出現(xiàn)大量游離的PR-A配體。而這些游離的PR-A配體與P4結(jié)合后募集相對活躍的Fra2/JunD異二聚體[29-30],從而激活CX43表達。

圖3 分娩前后P4/PR對Cx43轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[29]Fig.3 Regulation of CX43 transcription by P4/PR during pregnancy and labour[29]

2.3 P4/PR通過誘導(dǎo)上調(diào)CAP基因轉(zhuǎn)錄阻遏物ZEB1/2和STAT5b的表達維持肌層靜止

2.3.1 ZEB1/2和miRNAs在P4/PR功能性阻斷引發(fā)分娩過程中發(fā)揮重要作用Renthal等[34-35]的研究表明,P4/PR可以通過誘導(dǎo)鋅指結(jié)合E-box的轉(zhuǎn)錄抑制物ZEB1/TCF8/dEF1保持肌層靜止。它們不僅是miR-200家族成員的靶基因,也與CAP基因CX43以及OXTR的啟動子結(jié)合抑制其表達。miR-200的下調(diào)促進ZEB1和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB2/SIP2的進一步上調(diào)(圖4)。Spoelstra等[36]發(fā)現(xiàn)ZEB1在小鼠子宮肌層中高表達,并被P4/PR上調(diào)。此外Renthal等[35]還觀察到ZEB1和ZEB2的表達在交配后15.5 d妊娠小鼠的子宮肌層組織中升高,并隨著循環(huán)P4和PR功能的下降而急劇下降。使用RU486或細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)處理妊娠小鼠能夠誘導(dǎo)早產(chǎn),并且顯著抑制ZEB1/2的表達。與足月未分娩的小鼠子宮肌層組織相比,分娩子宮肌層中ZEB1和ZEB2的水平也降低。對懷孕的小鼠子宮肌層的ChIP-qPCR分析表明,內(nèi)源性ZEB1以相對較高水平結(jié)合到小鼠CX43和OXTR啟動子的E-box含區(qū),在交配后15.5 d妊娠時顯著下降。重要的是,ZEB1在人hTERT-HM細(xì)胞中的過度表達顯著抑制了OXTR和CX43mRNA的表達,并通過體外收縮試驗證明其阻斷了催產(chǎn)素誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮[35]。因此,ZEB1表達的減少和與CAP基因啟動子的結(jié)合可能會促進OXTR和CX43的上調(diào)并導(dǎo)致分娩。

為了進一步評估P4對ZEB表達的影響,每天定時給交配后15.5～18.5 d妊娠的小鼠注射P4或生理鹽水。與注射生理鹽水的小鼠相比,P4處理組延遲分娩,引起ZEB1顯著上調(diào)并抑制了子宮肌層CX43和OXTR基因的表達。P4對ZEB1表達的刺激作用是通過PR與ZEB1啟動子內(nèi)的反應(yīng)元件的直接結(jié)合介導(dǎo)的,僅在基因轉(zhuǎn)錄水平上起作用。值得注意的是ZEB2并不受P4/PR的直接調(diào)控。ZEB1和ZEB2是序列高度保守的miR-200家族的靶向基因[37-40],它們的表達量在足月分娩時的小鼠和人子宮肌層顯著增加,與ZEB1和ZEB2表達的下降有直接關(guān)系[35]。此外ZEB1和ZEB2還負(fù)調(diào)控miR-200表達。因此,ZEB1/2和miR-200存在于激素調(diào)節(jié)的負(fù)反饋回路中。因此,在懷孕期間升高的P4/PR會增加ZEB1的表達,從而抑制miR-200家族以及與收縮相關(guān)基因。miR-200表達減少進一步上調(diào)ZEB1,并增加ZEB2的表達。在母體接近分娩時循環(huán)中的P4和/或PR功能下降會導(dǎo)致ZEB1表達下調(diào),進而導(dǎo)致miR-200家族上調(diào),進一步抑制ZEB1和ZEB2。這會降低CAP基因的表達,導(dǎo)致子宮收縮力增加(圖4)。

miR-200家族在妊娠期上調(diào),與足月未分娩子宮肌層組織相比,保守的miR-199a/214簇在小鼠和人類[35,41]臨近分娩時子宮肌層中均顯著下調(diào)。由miR-199a-5p、miR-199a-3p和miR-214組成的miR-199a/-214 簇在ynamin 3基因(Dnm3os)的6 kb反義轉(zhuǎn)錄本中編碼,該轉(zhuǎn)錄本在懷孕子宮肌層高水平表達[42]。Williams等[41]發(fā)現(xiàn) E2對去卵巢小鼠子宮的miR-199a-3p/-214表達有抑制作用,而P4則有增強作用。由此可見這些相反的激素效應(yīng)是由ZEB1介導(dǎo)的,它是由P4誘導(dǎo)增強并由E2抑制。ZEB1直接與miR-199a/-214啟動子結(jié)合以激活其轉(zhuǎn)錄(圖4),其中miR-199a-3p和miR-214都靶向COX-2mRNA。以上發(fā)現(xiàn)均揭示了ZEB1作為miR-200家族抑制劑和miR-199a/-214簇誘導(dǎo)劑的重要作用,P4功能性阻斷和E2濃度增加則反向調(diào)節(jié)它們的下游功能(圖4)。

圖4 ZEB1、ZEB2和miRNAs介導(dǎo)P4/PR在妊娠和分娩前期對子宮肌層收縮力調(diào)控作用[34]Fig.4 Opposing actions of P4/PR on myometrial contractility during pregnancy and labor mediated by ZEB1,ZEB2 and miRNAs[34]

2.3.2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子STAT5b分娩前期P4在子宮肌層和子宮頸中的局部代謝增加會使PR功能下降,這對哺乳動物的分娩是至關(guān)重要的。Piekorz等[6]發(fā)現(xiàn)敲除20α-羥基類固醇脫氫酶(20α-HSD)基因的小鼠孕酮維持高水平,并表現(xiàn)出分娩時期延遲現(xiàn)象,說明20α-HSD在動物分娩過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。在足月孕婦的子宮肌層中,觀察到P4與20α-二氫孕酮(20α-OHP)的比值顯著降低,而后者是由20α-HSD產(chǎn)生的無活性的P4代謝產(chǎn)物。Williams等[31]研究發(fā)現(xiàn)miR-200直接靶向P4誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子STAT5b,而后者是生殖組織中20α-HSD的負(fù)調(diào)控因子[6]。因此可推斷在分娩期間小鼠和人子宮肌層中miR-200表達的上調(diào)與抑制STAT5b和誘導(dǎo)20α-HSD有關(guān)。與此相反,在整個妊娠的大部分時間里,P4水平升高會上調(diào)ZEB1并抑制子宮內(nèi)膜中miR-200的表達;而在妊娠期間STAT5b的上調(diào)表達會抑制20α-HSD的表達以維持升高的內(nèi)源性P4水平和肌層靜止(圖4)。

2.4 P4/PR可能通過誘導(dǎo)Caspase級聯(lián)反應(yīng)活化并降解CAP蛋白以維持肌層靜息狀態(tài)

Shynlova等[43]在大鼠的妊娠早期至中期子宮平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷,再對增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)染色后,發(fā)現(xiàn)子宮肌層細(xì)胞表現(xiàn)出較高增殖能力,而到了分娩前期17 日胎齡(足月為23 日胎齡)卻急劇下降,并伴隨著肥大性細(xì)胞的增加;在12～15 日胎齡的子宮平滑肌細(xì)胞中出現(xiàn)了顯著的應(yīng)激誘導(dǎo)的半胱天冬酶(Caspase)級聯(lián)反應(yīng)(即出現(xiàn)了裂解的Caspase 9、3、6和7)。所以,Caspase酶激活可能導(dǎo)致抑制肌層增生活性并促進向肥大和平滑肌細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)變。此外,Jeyasuria等[44]在妊娠小鼠12～15 日胎齡(足月為 19 日胎齡)子宮肌層,也觀察到類似的Caspase級聯(lián)激活的誘導(dǎo)變化。與空白組相比,胱天蛋白酶3的激活反應(yīng)在P4處理組中尤為明顯。Kyathanahalli等[45]報道,Caspase 3的激活伴隨著一系列肌細(xì)胞收縮相關(guān)蛋白(CAP)如平滑肌α-和γ-肌動蛋白的裂解以及間隙連接蛋白CX43的下調(diào)表達。因此,可以認(rèn)為P4/PR在懷孕期間維持肌層靜止是通過其誘導(dǎo)Caspase級聯(lián)反應(yīng)和引起參與肌層收縮蛋白質(zhì)降解而發(fā)揮作用。妊娠子宮肌層在妊娠晚期PR功能性阻斷導(dǎo)致Caspase酶激活通路被抑制,使得CAP在細(xì)胞中積累。此外值得注意的是,Suresh等[46]研究發(fā)現(xiàn)子宮肌細(xì)胞中Caspase酶的激活還與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress response,ERSR)的誘導(dǎo)有關(guān),而ERSR是可以通過其他生理或機械刺激來增強其作用的。

3 雌性哺乳動物P4/PR功能性阻斷引起分娩啟動的主要機制

P4對于妊娠的建立和維持是必不可少的[47]。Corner等[48-49]在19世紀(jì)20年代進行了開創(chuàng)性的工作,到50代由Csapo[50]提出了“孕酮阻斷”假說。雌性哺乳動物妊娠期間血液中的孕酮水平主導(dǎo)著妊娠的內(nèi)分泌環(huán)境,但孕激素的來源因物種而異。在某些物種(如小鼠、大鼠、兔子)中,孕酮是由母體黃體(corepus luteum,CL)合成的,而在其他物種(如綿羊)中,它是由胎盤合成的。此后,大量的臨床、動物體內(nèi)和體外研究結(jié)果都有力地支持了“孕酮阻斷”假說。目前的共識是,孕酮對妊娠的建立和維持是必不可少的,抑制孕酮的產(chǎn)生和/或干擾/調(diào)節(jié)其在子宮肌層細(xì)胞中的活性會導(dǎo)致足月分娩或早產(chǎn),該事件是分娩啟動的關(guān)鍵性因素。隨著研究的深入,已經(jīng)認(rèn)識到甾體激素影響靶細(xì)胞的分子機制和黃體酮促進肌層靜止的機制,以及如何從功能上撤銷其分娩阻斷作用以引發(fā)人類分娩?，F(xiàn)在很清楚雌性動物子宮肌層細(xì)胞中孕激素的作用主要是由該孕激素受體(PR)亞型PR-A和PR-B介導(dǎo)的,PR亞型作用的調(diào)節(jié)是功能性孕激素阻斷的關(guān)鍵[51]。下面就引起孕酮功能性阻斷的主要機制進行闡述和圖示(圖5)。

圖5 雌性哺乳動物P4/PR功能性阻斷引起分娩啟動的主要機制Fig.5 The mechanisms for initiation of term parturition induced by P4/PR functional blockade in female mammals

3.1 子宮肌層細(xì)胞通過PR-A豐度的變化及其對PR-B的反式抑制轉(zhuǎn)錄活性來降低對P4的反應(yīng)性

目前解釋功能性黃體酮阻斷的主要假設(shè)是基于PR-A對PR-B的相反式抑制轉(zhuǎn)錄活性。大多數(shù)孕酮反應(yīng)性細(xì)胞中,包括子宮肌層細(xì)胞都表達兩種PR同工型(PR-A、PR-B),PR-A和PR-B的凈轉(zhuǎn)錄活性代表了對孕酮的反應(yīng)。最初在使用人工啟動子-報告基因檢測的研究中,發(fā)現(xiàn)PR-B在大多數(shù)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性均高于PR-A,并且PR-A會降低PR-B的轉(zhuǎn)錄活性(稱為轉(zhuǎn)錄抑制)。這些發(fā)現(xiàn)引出PR-A/PR-B致功能性孕酮阻斷的假說,認(rèn)為在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中PR-A相對于PR-B的增加抑制了孕激素-PR的抗炎阻滯作用。后來的研究數(shù)據(jù)也表明足月女性分娩的發(fā)生與子宮內(nèi)膜中PR-A相對于PR-B的增加有關(guān)[3,52-54],并且PR-A降低了孕激素誘導(dǎo)的PR轉(zhuǎn)錄和PR-A/PR-B假說支持肌層細(xì)胞培養(yǎng)物中的抗炎活性[25,32]。子宮肌層細(xì)胞中PR-A豐度和反式抑制活性的調(diào)節(jié)是功能性黃體酮阻斷機制引起分娩的關(guān)鍵因素。

3.2 通過翻譯后修飾調(diào)節(jié)PR的活性,調(diào)控抗炎和CAP基因等轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB和AP-1)的表達

Peters等[32]發(fā)現(xiàn)促炎性刺激增加了肌層細(xì)胞中PR-A的豐度和反式抑制活性。Amini等[33]發(fā)現(xiàn)促炎性刺激作用是通過誘導(dǎo)PR-A的位點特異性絲氨酸磷酸化來實現(xiàn)的。PR-A和PR-B的磷酸化是PR轉(zhuǎn)錄活性的細(xì)胞特異性和環(huán)境特異性調(diào)節(jié)機制,以調(diào)節(jié)靶細(xì)胞孕酮反應(yīng)性[51]。Chen等[4]在穩(wěn)定表達PR-A或PR-B的hTERT-HM子宮肌層細(xì)胞中,觀察到與表達PR-B的細(xì)胞相比,P4在表達PR-A的細(xì)胞中的抗炎活性顯著降低[4]。此外,炎癥前刺激以P4依賴性方式增加了Ser344/345上PR-A同工型的磷酸化,并增強了其抑制PR-B的抗炎活性[33]。值得注意的是,在分娩和非分娩雌性子宮肌層中,Ser345的磷酸化僅發(fā)生在PR-A上。相對于總PR-A來說,分娩子宮肌層的磷酸Ser345-PR-A的豐度顯著高于非分娩子宮肌層,并且這種磷酸化的PR-A有助于增加NF-κB的活化能力。

3.3 妊娠晚期子宮肌層PR抗炎活性的轉(zhuǎn)錄共抑制子減少

靶基因表達的P4/PR活化取決于共活化復(fù)合物的募集,該復(fù)合物含有引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)解開的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶[55-56]。Condon等[57]的研究表明分娩前的雌鼠子宮肌層中環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element-binding protein,CREB)和類固醇受體共激活因子(steroid receptor coactivator,SRC)的表達急劇下降,顯著低于妊娠期雌鼠子宮肌層組織中的表達量。值得注意的是,對妊娠晚期孕鼠注射曲古抑素A(一種特異性組氨酸去乙?；敢种苿?可增加組蛋白乙?；?并將分娩啟動延遲24～48 h,表明組蛋白乙?；诖剖蠓置鋯又邪l(fā)揮重要作用。在含HDAC抑制劑培養(yǎng)的人子宮肌層細(xì)胞的研究中,促炎基因下調(diào)表達,并強烈抑制了人子宮肌層的收縮性[58-59]。上述研究表明,妊娠后期子宮肌層中PR共激活因子的表達降低和組蛋白乙?；赡軙魅鮌4/PR上調(diào)維持子宮肌層靜止基因的能力,并增加子宮對前列腺素和其他收縮因子的敏感性。Leitet等[60]在培養(yǎng)人肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TNFα抑制SRC-1和SRC-2的表達,引起PR-B轉(zhuǎn)錄活性降低。因此,短期內(nèi)子宮肌層中共激活因子的減少可能是由誘導(dǎo)前炎癥介質(zhì)引起的。此外,與PR相互作用并介導(dǎo)其抑制促炎癥和CAP基因表達的GATAD2B[4]和p54nrb(non-POU-domain-containing octamer binding protein,不含POU域八聚體結(jié)合蛋白)[61]等共抑制因子在分娩前孕鼠子宮肌層減少,也將進一步導(dǎo)致PR功能下降。

3.4 P4在子宮肌層和子宮頸中的代謝水平增加導(dǎo)致PR功能下降和分娩

在大多數(shù)雌性動物的卵巢黃體和胎盤產(chǎn)生大量孕酮,維持整個妊娠過程血漿中較高的孕酮水平[62],同時妊娠期間子宮肌層中PR高水平表達可保證孕酮激素的正常功能[5]。而在妊娠后期雌性動物子宮肌層中的孕酮與20α-二氫孕酮(20α-OHP)的比例顯著降低。小鼠分娩的啟動伴隨著P4代謝酶表達的增加,如子宮中20α-HSD的表達[31]和子宮頸中5α-還原酶Ⅰ型的表達。即使母體血漿中的P4水平正常下降,敲除Ⅰ型5α-還原酶基因的小鼠也會因子宮頸成熟度不足而無法完成分娩。同樣,20α-HSD基因敲除小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的分娩延遲[7,63]。因此,短期內(nèi)子宮和子宮頸中P4的局部代謝增加導(dǎo)致PR功能下降,并且對于分娩的啟動起著重要影響。

4 結(jié)論與研究展望

4.1 妊娠期間,P4/PR在維持肌層靜止中的關(guān)鍵作用主要是由其抑制炎癥途徑和抑制CAP基因表達的能力介導(dǎo)

在整個妊娠期間P4/PR在維持肌層靜止中的關(guān)鍵作用主要是由其抑制炎癥途徑和抑制CAP基因的表達能力介導(dǎo)的,主要是通過幾種合作機制發(fā)生的(圖2)。這些機制包括:P4/PR通過與促炎基因和CAP基因啟動子內(nèi)NF-κB反應(yīng)元件(NF-κB PRE)結(jié)合的NF-κB p65結(jié)合,募集不同的共抑制子發(fā)揮抗炎和抑制收縮的作用。P4/PR通過與AP-1轉(zhuǎn)錄因子(Jun/Jun同源二聚體)結(jié)合,通過與轉(zhuǎn)錄共抑制因子p54/Msin3A相互作用,并將其招募到AP-1共有結(jié)合位點,介導(dǎo)Cx43的轉(zhuǎn)錄抑制。

P4/PR通過與IκBα和MKP-1啟動子結(jié)合并增強其表達,它們在子宮肌層抑制NF-κB活化、CAP基因表達和促炎癥。P4/PR的升高還上調(diào)了轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的表達,該轉(zhuǎn)錄因子ZEB1與OXTR和CX43基因的啟動子直接相互作用,抑制其表達并抑制miR-200家族的表達。miR-200表達的降低導(dǎo)致其靶標(biāo)STAT5b(20α-HSD的轉(zhuǎn)錄抑制劑)上調(diào),從而防止子宮肌層中的P4代謝增強。增加的ZEB1還上調(diào)了直接靶向COX-2的miR-199a/-214簇成員的表達,從而抑制收縮性前列腺素的合成(圖2、4)。P4/PR通過活化Caspase級聯(lián)反應(yīng)降解收縮性蛋白,起到維持子宮肌層靜息的作用。

4.2 妊娠后期各種因素導(dǎo)致PR功能性阻斷是子宮肌層從靜息狀態(tài)向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵信號

在母體和胎兒的共同信號作用下會引起足月妊娠子宮肌層向炎性收縮狀態(tài)的轉(zhuǎn)變(圖1)。這些活化的免疫細(xì)胞然后遷移到母體子宮,通過激活NF-κB和AP-1而促進炎癥反應(yīng),導(dǎo)致PR功能下降,并在子宮內(nèi)膜中增加炎癥原和CAP基因的表達(圖1)。目前,引起子宮肌層PR功能性阻斷主要由以下因素介導(dǎo):炎癥誘導(dǎo)的PR-A相對于PR-B表達豐度增加,并對PR-B的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生反式抑制作用;ZEB1的表達降低并協(xié)調(diào)誘導(dǎo)miR-200家族表達,導(dǎo)致STAT5b的抑制,20α-HSD的上調(diào)和P4的局部代謝的增加;NF-κB p65與PR的直接相互作用;PR共激活因子的下降。此外,ZEB1的下降還有助于OXTR和CX43的上調(diào),并通過誘導(dǎo)靶標(biāo)COX-2和PGF2α的合成來降低miR-199a/-214的表達。妊娠晚期子宮肌層中E2的增加會激活ERα,而這會引起子宮肌層出現(xiàn)炎癥前反應(yīng)和CAP基因表達的增加。這部分作用主要是通過抑制ZEB1/2和降低miR-181b的表達來介導(dǎo)的,上調(diào)ERα、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α,TNFα)以及c-FOS等靶基因。這些高度協(xié)調(diào)的分子事件、子宮肌層擴張增加以及PR共表達的下調(diào),最終導(dǎo)致子宮肌層收縮力增加從而引起分娩。通過上面對孕期子宮肌層靜息及其在分娩前轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)機制的闡述不難看出,P4及其受體在此過程中起到了關(guān)鍵作用,可為我們進一步研究人類及生產(chǎn)性動物分娩啟動提供有益的參考。

4.3 展望

早產(chǎn)導(dǎo)致大量新生兒發(fā)病和死亡,是目前亟待解決的重要社會問題。通過上面對孕期子宮肌層靜息及其在分娩前轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)機制的闡述可以看出，P4及其受體在此過程中起到了關(guān)鍵作用，我們希望將這些研究結(jié)果應(yīng)用于預(yù)防早產(chǎn)藥物的開發(fā)。在維持子宮肌層靜息狀態(tài)的同時，產(chǎn)生更多非代謝性孕激素，或者是通過抑制炎癥途徑，以防止早產(chǎn)高危孕婦的子宮肌層活化。進一步研究免疫調(diào)節(jié)劑在抑制子宮肌層炎癥反應(yīng)過程中的作用，并對高危孕婦的早產(chǎn)風(fēng)險進行重新評估。此外對孕酮功能阻斷機制如miRNA簇信號分子作用途徑的研究，不僅可為人類開發(fā)新的靶向性藥物來預(yù)防早產(chǎn)提供理論依據(jù)，也可為精確調(diào)控生產(chǎn)性哺乳動物分娩時間和縮短產(chǎn)程提供新的藥物處理方案。