王綠陽,康翠翠,丁立人,馮江銀,洪秋霞,游美敬,保浩宇,杭蘇琴*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家動(dòng)物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心/江蘇省消化道營養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/消化道微生物研究室,江蘇 南京 210095;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)類國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,江蘇 南京 210095)

養(yǎng)豬生產(chǎn)中,采食量是影響豬生產(chǎn)性能的關(guān)鍵因素之一。研究表明,給豬自由采食的基礎(chǔ)上再強(qiáng)飼20%,其體重可提高40%[1],說明提高采食量促進(jìn)了動(dòng)物生長。動(dòng)物采食量主要與由十二指腸以及空腸近端Ⅰ細(xì)胞分泌的胃腸飽感激素膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)有關(guān)[2-3]。研究表明CCK主動(dòng)免疫可以促進(jìn)豬的采食,提高生長性能[4],說明CCK參與豬的采食調(diào)控。氨基酸可有效刺激CCK分泌,其中芳香族氨基酸——苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)能顯著刺激嚙齒類動(dòng)物小腸分泌CCK[5]。人體十二指腸灌注L-Phe可升高血液CCK濃度,降低胃腸蠕動(dòng)速率,抑制機(jī)體食欲[6]。這表明日糧或蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的Phe可能同樣刺激豬CCK分泌。

胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞(enteroendocrine cells,EEC)表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)型受體(G protein-coupled receptors,GPCR)參與介導(dǎo)胃腸激素的分泌,這些受體包括鈣敏感受體(calcium sensing receptor,CaSR)和鮮味受體(type 1 taste receptor 1/3,T1R1/T1R3)[7]。研究發(fā)現(xiàn),CaSR和T1R1/T1R3可介導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物CCK的分泌[8-9],但這2個(gè)受體是否同樣介導(dǎo)Phe刺激豬CCK分泌還不清楚。胞內(nèi)磷脂酶C(phospholipase C,PLC)是介導(dǎo)CCK分泌的關(guān)鍵分子,其催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(4,5-phosphatidylinositol bisphosphate,PIP2)分解產(chǎn)生的1,4,5-三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放Ca2+[10]。另一方面,細(xì)胞膜陽離子通道蛋白瞬時(shí)受體電位離子通道蛋白5(transient receptor potential subfamily M member 5,TRPM5)的打開也依賴于胞內(nèi)Ca2+濃度變化,尤其是PLC活化誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度升高[11],因此下游PLC/TRPM5可能是介導(dǎo)CCK分泌的關(guān)鍵分子。

目前關(guān)于氨基酸對胃腸激素分泌及食欲影響的研究主要集中于嚙齒類動(dòng)物或內(nèi)分泌細(xì)胞系,而嚙齒類動(dòng)物與豬胃腸道氨基酸感應(yīng)受體的表達(dá)存在差異[12-13]。此外,相比于內(nèi)分泌細(xì)胞系,腸道組織培養(yǎng)能夠保證細(xì)胞所處的環(huán)境基本保持完整,并能保留細(xì)胞極性[14]。因此,本研究以CCK分泌的主要部位——豬十二指腸組織為研究模型,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期建立的組織體外灌流方法,探究Phe對豬十二指腸組織CCK分泌的影響及其潛在機(jī)制,以期為從營養(yǎng)角度調(diào)控豬的采食奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

CaSR抑制劑NPS 2143、calhex 231和PLC抑制劑U-73122均購自MedChem Express公司;L(D)-Phe、T1R1/T1R3激活劑肌苷酸(inosine monophosphate,IMP)、TRPM5抑制劑氧化三苯基磷(triphenylphophine oxide,TPPO)購自上海源葉生物科技有限公司;T1R1/T1R3抑制劑lactisole購自Cayman Chemical公司;豬膽囊收縮素(CCK)ELISA試劑盒購自南京奧青生物技術(shù)有限公司;CaSR抗體(MA1-934)和山羊抗鼠IgG(H+L)均購自Thermo Pierce公司,β-actin抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 豬十二指腸組織灌流試驗(yàn)

1.2.1 灌流組織的采集及灌流樣品制備用無菌蒸餾水配制0.01 mol·L-1PBS(135 mmol·L-1NaCl、8 mmol·L-1K2HPO4、2.7 mmol·L-1KCl、1.5 mmol·L-1KH2PO4,pH7.2),用于沖洗十二指腸組織中的食糜;配制基礎(chǔ)(Kreb’s)緩沖液(136.87 mmol·L-1NaCl、3.0 mmol·L-1CaCl2、4.02 mmol·L-1KCl、2.10 mmol·L-1MgCl2、25.18 mmol·L-1HEPES、33.33 mmol·L-1Glucose,pH7.4),用于組織灌流。

豬十二指腸組織采集于江蘇省南京市當(dāng)?shù)赝涝讏?試驗(yàn)豬體重100～130 kg,品種為杜洛克×長白×約克夏三元雜交豬。豬屠宰后,立即采集長約6 cm的豬近端十二指腸,放置于充滿氣體(含95% O2和5% CO2)的預(yù)冷Kreb’s緩沖液中,于1 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室,立即將組織放置于無菌操作臺(tái),參照談寅飛等[15]和Xian等[16]的方法,剪取長3 cm左右的豬十二指腸,去除腸系膜脂肪后將腸道縱向剖開,用0.01 mmol·L-1PBS沖洗。將洗凈的組織切成約1 mm3的組織塊,混勻,按照每組400 mg稱量并隨機(jī)放入灌流小室。試驗(yàn)中所用的樣品均來自3頭豬的十二指腸組織混合物。

1.2.2 組織灌流程序灌流裝置詳見Wang等[17]的描述。灌流試驗(yàn)開始前,通過蠕動(dòng)泵將含有氣體的灌流液引入灌流小室,用水浴鍋預(yù)熱,使灌流小室液體溫度達(dá)到37 ℃。將制備好的豬十二指腸組織放入灌流小室,調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵速率為6 mL·h-1,用Kreb’s緩沖液預(yù)灌流20 min,使所有十二指腸組織處于同一狀態(tài)。組織灌流程序如圖1所示。試驗(yàn)一:根據(jù)Feng等[18]的方法并進(jìn)行調(diào)整,分別用0、10、20和50 mmol·L-1的L-Phe溶液進(jìn)行灌流(圖1-A),篩選刺激豬十二指腸組織分泌CCK的L-Phe濃度;試驗(yàn)二:分別用D-Phe和L-Phe刺激組織比較氨基酸構(gòu)型對CCK分泌的影響(圖1-B);試驗(yàn)三:分別在灌流液中加入CaSR抑制劑NPS 2143(25 μmol·L-1)和calhex 231(20 μmol·L-1),T1R1/T1R3激動(dòng)劑IMP(2.5 mmol·L-1)和抑制劑lactisole(5 mmol·L-1),PLC抑制劑U-73122(10 μmol·L-1)和TRPM5抑制劑TPPO(100 μmol·L-1),探究CaSR、T1R1/T1R3和下游信號(hào)分子PLC、TRPM5在L-Phe刺激CCK分泌過程中的作用(圖1-C)。將試驗(yàn)過程中收集的灌流液4 ℃、10 000 r·min-1離心5 min,收集上清液,-20 ℃保存用于后續(xù)CCK濃度的測定。

圖1 豬十二指腸組織灌流程序圖Fig.1 The perfusion procedure of porcine duodenum A.不同濃度L-Phe對CCK分泌的影響;B. Phe構(gòu)型對CCK分泌的影響;C.激活或抑制CaSR、T1R1/T1R3、PLC和TRPM5對L-Phe刺激CCK分泌的影響。A. Effects of different concentrations of L-Phe on CCK secretion;B. Effects of different configurations of Phe on CCK secretion;C. Effects of activation or inhibition of CaSR,T1R1/T1R3,PLC,and TRPM5 on L-Phe stimulated CCK secretion.

圖2 豬十二指腸CaSR蛋白的表達(dá)Fig.2 Protein expression of CaSR in porcine duodenum

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 十二指腸CaSR蛋白免疫印跡檢測在南京市某屠宰場再采集3頭豬的十二指腸組織。提取組織蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE,之后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上,用含50 g·L-1脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h,再分別加CaSR(1∶2 000)和β-actin抗體(1∶1 500)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌4次后,用二抗山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG,H+L,1∶5 000)室溫孵育1 h。TBST洗滌3次,加入ECL發(fā)光底物后曝光,拍照。

1.3.2 灌流液CCK濃度測定嚴(yán)格按照豬CCK ELISA試劑盒說明書檢測灌流液中的CCK濃度。試劑盒檢測濃度為10～200 ng·L-1,批間變異系數(shù)小于15%,批內(nèi)變異系數(shù)小于9%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 豬十二指腸CaSR蛋白的表達(dá)

如圖1所示:3頭豬的十二指腸均存在CaSR蛋白表達(dá),且清晰度、條帶數(shù)均較相似。

2.2 Phe對CCK分泌水平的影響

為了探討不同濃度氨基酸對CCK分泌水平的影響,本試驗(yàn)分別用0、10、20和50 mmol·L-1L-Phe進(jìn)行豬十二指腸灌流,并檢測灌流液中的CCK濃度。結(jié)果如圖3-B所示:與對照組(0 mmol·L-1Phe)相比,50 mmol·L-1L-Phe能夠顯著促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌(P<0.05),而10、20 mmol·L-1L-Phe并不能促進(jìn)CCK的分泌(P>0.05)。為進(jìn)一步探討CCK分泌是否與氨基酸的構(gòu)型(D-型和L-型)有關(guān),在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,均分別選取0、50 mmol·L-1D-Phe和L-Phe 進(jìn)行豬十二指腸灌流。結(jié)果圖(3-D)顯示:與0 mmol·L-1L-Phe相比,50 mmol·L-1L-Phe能夠顯著促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌(P<0.05),而50 mmol·L-1D-Phe未能促進(jìn)CCK的分泌(P>0.05),說明Phe促進(jìn)CCK分泌與其特定結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖3 Phe濃度(A、B)及構(gòu)型(C、D)對CCK分泌的影響Fig.3 Effects of Phe concentration(A,B)and configuration(C,D)on CCK level不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters mean significant difference(P<0.05). The same as follows.

2.3 CaSR抑制劑對CCK分泌水平的影響

如圖4所示:與對照組(0 mmol·L-1L-Phe)相比,50 mmol·L-1L-Phe顯著促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌,但加入CaSR抑制劑NPS 2143或calhex 231后,L-Phe引起的CCK分泌被顯著抑制(P<0.05)。這表明CaSR參與介導(dǎo)L-Phe刺激豬十二指腸分泌CCK。

圖4 CaSR抑制劑NPS 2143(A、B)和calhex 231(C、D)對CCK分泌的影響Fig.4 Effects of CaSR inhibitors NPS 2143(A,B)and calhex 231(C,D)on CCK level

2.4 T1R1/T1R3抑制劑和激動(dòng)劑對CCK水平的影響

如圖5所示:與對照組(0 mmol·L-1L-Phe)相比,50 mmol·L-1L-Phe顯著促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌,但加入T1R1/T1R3激動(dòng)劑IMP和抑制劑lactisole后,L-Phe引起的CCK分泌并無顯著變化(P>0.05)。這表明T1R1/T1R3并未參與介導(dǎo)L-Phe刺激豬十二指腸CCK的分泌。

圖5 T1R1/T1R3激動(dòng)劑IMP(A、B)和抑制劑lactisole(C、D)對CCK分泌的影響Fig.5 Effects of T1R1/T1R3 agonist IMP(A,B)and inhibitor lactisole(C,D)on CCK level

2.5 PLC和TRPM5抑制劑對L-Phe誘導(dǎo)的CCK水平的影響

如圖6所示:與對照組(0 mmol·L-1L-Phe)相比,50 mmol·L-1L-Phe顯著促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌,但分別加入下游信號(hào)分子PLC抑制劑U-73122和TRPM5抑制劑TPPO后,L-Phe引起的CCK分泌均顯著降低(P<0.05)。這表明L-Phe刺激CCK分泌需要下游信號(hào)分子PLC和TRPM5的參與。

圖6 PLC抑制劑U-73122(A、B)和TRPM 5抑制劑TPPO(C、D)對CCK水平的影響Fig.6 Effects of PLC inhibitor U-73122(A,B)and TRPM5 inhibitor TPPO(C,D)on CCK levels

3 討論

3.1 豬十二指腸CaSR蛋白的表達(dá)

作為跨膜蛋白,CaSR由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域3個(gè)獨(dú)立的部分構(gòu)成[19]。為探究CaSR在Phe刺激豬十二指腸分泌CCK中的作用,本研究驗(yàn)證了豬十二指腸存在CaSR蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,豬的CaSR為相對分子質(zhì)量130 000和150 000的條帶,人和嚙齒類動(dòng)物蛋白結(jié)果同樣顯示CaSR包含130 000和150 000蛋白條帶[20-21]。研究顯示,檢測到的130 000條帶是位于胞內(nèi)的、未修飾的不成熟結(jié)構(gòu),150 000條帶是位于細(xì)胞膜、經(jīng)糖基化修飾后的成熟結(jié)構(gòu),其糖基化結(jié)構(gòu)包括甘露糖或復(fù)合碳水化合物,并被認(rèn)為對CaSR在細(xì)胞表面的定位、從細(xì)胞內(nèi)向膜運(yùn)輸以及蛋白的折疊至關(guān)重要[22]。斷奶仔豬胃腸道CaSR的表達(dá)由強(qiáng)到弱依次為回腸、空腸、胃、十二指腸、結(jié)腸,這可能與營養(yǎng)物質(zhì)主要在小腸被吸收有關(guān)。研究表明CaSR的主要激活劑Ca2+有超過60%被回腸吸收、20%左右被空腸和十二指腸吸收,剩下的被胃和大腸吸收。因此,CaSR在豬胃腸道的分布模式與不同腸段對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的相對貢獻(xiàn)是一致的[23]。

3.2 Phe對CCK分泌的影響

作為必需氨基酸,L-Phe灌胃能顯著提高嚙齒類動(dòng)物血液CCK水平并抑制機(jī)體食欲[5]。此外,人體十二指腸灌注L-Phe同樣能夠提高血液CCK水平,降低機(jī)體能量攝入[24]。說明L-Phe是CCK分泌的刺激物。本研究表明,50 mmol·L-1L-Phe能夠顯著刺激豬十二指腸CCK的分泌,而10和20 mmol·L-1無此效應(yīng)。但目前不同研究中L-Phe刺激CCK分泌的水平并不一致,對嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞系的研究顯示L-Phe刺激CCK分泌的濃度是10 mmol·L-1或20 mmol·L-1[11,25],這可能是由細(xì)胞系和十二指腸組織之間的差異引起的。另外,同屬于芳香族氨基酸的L-色氨酸(L-tryptophan,L-Trp)在20 mmol·L-1時(shí)便可顯著刺激豬十二指腸分泌CCK,這表明氨基酸的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)影響激素的分泌[26]。同時(shí),僅L-Phe可以刺激CCK分泌而非D-Phe,表明氨基酸構(gòu)型同樣是影響CCK分泌的因素。除了CCK,L-Phe還是其他胃腸激素分泌的刺激物。L-Phe體外灌流還可以刺激嚙齒類動(dòng)物腸道和結(jié)腸L細(xì)胞分泌胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)和酪酪肽(peptite YY,PYY)[27]。此外,滲透壓可能是刺激激素分泌的因素之一[28-29],但本研究中L-Phe誘導(dǎo)CCK的分泌與滲透壓無關(guān),因?yàn)?0 mmol·L-1D-Phe并沒有出現(xiàn)該效應(yīng)。

3.3 CaSR 和T1R1/T1R3在L-Phe誘導(dǎo)的CCK分泌中的作用

為進(jìn)一步探究CaSR和T1R1/T1R3的作用,本研究首先在灌流液中分別加入CaSR特異性抑制劑NPS 2143和calhex 231,發(fā)現(xiàn)L-Phe對CCK的促分泌作用消失,這表明L-Phe促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌依賴于CaSR。同時(shí),抑制劑NPS 2143和Calhex 231的濃度也被證明對細(xì)胞活力和CCK的分泌沒有影響[25,30]。加入T1R1/T1R3激動(dòng)劑IMP或拮抗劑lactisole后,L-Phe刺激的CCK分泌并無顯著變化,這表明T1R1/T1R3并未參與介導(dǎo)L-Phe刺激豬十二指腸CCK的分泌,這與對嚙齒類動(dòng)物以及小鼠細(xì)胞系的研究結(jié)果存在差異。嚙齒類動(dòng)物和豬T1R1/T1R3蛋白的同源性只有73%[31],這可能是本研究與嚙齒類動(dòng)物研究中T1R1/T1R3對L-Phe的感應(yīng)存在差異的原因。

作為氨基酸感應(yīng)體,CaSR和T1R1/T1R3均屬于G蛋白偶聯(lián)型受體C家族,其中CaSR主要感應(yīng)芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨基酸),而T1R1/T1R3可識(shí)別20多種L-氨基酸,尤其對L-谷氨酸(L-glutamate,L-Glu)敏感[32]。Daly等[9]對小鼠近端小腸的研究發(fā)現(xiàn),L-Phe能夠同時(shí)激活CaSR和T1R1/T1R3誘導(dǎo)CCK分泌,但L-Glu只能通過T1R1/T1R3誘導(dǎo)激素分泌。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也表明,T1R1/T1R3能介導(dǎo)L-Glu刺激豬十二指腸CCK的分泌[33]。結(jié)合本研究,L-Phe和L-Glu可能分別通過激活CaSR和T1R1/T1R3刺激豬十二指腸CCK的分泌。

3.4 PLC和TRPM5在L-Phe誘導(dǎo)的CCK分泌中的作用

關(guān)于胃腸道PLC/TRPM5信號(hào)通路的研究已經(jīng)很多,尤其是在介導(dǎo)胃腸激素分泌中的作用。研究表明,抑制PLC活性能夠減弱H2S刺激小鼠STC-1細(xì)胞GLP-1和PYY的分泌[34]。此外,嘔吐毒素刺激小鼠STC-1細(xì)胞CCK的分泌依賴于TRPM5的激活[35]。本文進(jìn)一步研究了PLC/TRPM5在L-Phe刺激豬十二指腸CCK中的分泌。結(jié)果表明,灌流液中分別加入PLC和TRPM5特異性抑制劑U-73122和TPPO后,L-Phe 對CCK的促分泌作用消失,這表明PLC/TRPM5同樣介導(dǎo)L-Phe刺激豬十二指腸CCK的分泌。此外,PLC活化而引起的TRPM5通道的打開能夠引發(fā)胞外Na+內(nèi)流,從而升高胞內(nèi)膜電位,誘導(dǎo)細(xì)胞去極化[36];細(xì)胞去極化能夠造成質(zhì)膜上電壓門控鈣離子通道(voltage-gated calcium channel,VGCC)的打開,進(jìn)一步提高胞內(nèi)Ca2+濃度[37]。最新的研究表明,直接誘導(dǎo)細(xì)胞去極化的發(fā)生就足以促使內(nèi)分泌細(xì)胞GLUTag分泌GLP-1,說明細(xì)胞去極化也是胃腸激素分泌的誘因之一[38]。因此推測PLC/TRPM5可能會(huì)進(jìn)一步通過誘導(dǎo)細(xì)胞去極化與胞內(nèi)升高的Ca2+濃度協(xié)同促進(jìn)CCK分泌。

本試驗(yàn)證明了豬十二指腸表達(dá)CaSR,揭示CaSR、T1R1/T1R3、PLC和TRPM5的激活劑或抑制劑在L-Phe 刺激豬十二指腸CCK分泌中的作用。但是本研究僅僅證明了PLC和TRPM5在其中的介導(dǎo)作用,而Ca2+作為二者之間信號(hào)傳遞者的作用未被證實(shí);同時(shí)體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜,需要利用激活劑或抑制劑進(jìn)一步驗(yàn)證CaSR、PLC和TRPM5在其中的作用。