李 磊，徐志鵬，夏 群，邱兆磊，程 峰，竇賀賀，姜 海，宋 琦，王振杰

腸道屏障是由腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IECs)之間的緊密連接組成的，是抵御有害物質(zhì)由腸道入侵機(jī)體的關(guān)鍵[1]。在創(chuàng)傷失血性休克(traumatic hemorrhagic shock，THS)中，人體血量的再分配顯著減少腸黏膜的血流量，以優(yōu)化心臟和大腦等重要器官的血供。然而，缺血缺氧性損傷對(duì)IECs的另一個(gè)后果是ATP減少和緊密連接破裂，進(jìn)一步導(dǎo)致腸道屏障功能障礙[2]。腸道含有的大量細(xì)菌和其他微生物分子從腸道移位到循環(huán)系統(tǒng)被認(rèn)為是該系統(tǒng)介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要貢獻(xiàn)者[3]。人們逐漸認(rèn)識(shí)到腸屏障功能的損害成為THS誘導(dǎo)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的啟動(dòng)和發(fā)展的關(guān)鍵因素[4]。因此，預(yù)防或改善腸屏障功能障礙將是預(yù)防THS相關(guān)MODS發(fā)生一個(gè)關(guān)鍵的治療策略。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，人類疾病與腸道益生菌越來(lái)越相關(guān)，而乳酸菌(LAB)作為最具有代表性的益生菌研究最為廣泛[5]。而目前對(duì)于THS在應(yīng)用新型復(fù)蘇液醋酸鈉林格液復(fù)蘇基礎(chǔ)上應(yīng)用乳酸菌探究對(duì)腸黏膜屏障的保護(hù)作用的研究較少。

既往研究[6-7]表明，TLR4-MAPK信號(hào)通路與急性腸道/肺損傷密切相關(guān)。因此針對(duì)TLR4-MAPK信號(hào)通路研究醋酸鈉林格液復(fù)蘇聯(lián)合乳酸菌對(duì)THS大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用是可行的。本研究通過(guò)前期應(yīng)用乳酸菌素片飼養(yǎng)SD大鼠，后期通過(guò)建立THS模型，探究醋酸鈉林格液復(fù)蘇基礎(chǔ)上應(yīng)用乳酸菌對(duì)THS大鼠腸黏膜屏障作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 取健康SD大鼠30只，SPF級(jí)，雌雄不限，體質(zhì)量(270±10)g(由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)。于蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心在室溫(22±1)℃、濕度40%～45%、以12 h光照/黑暗周期下飼養(yǎng)1周。乳酸菌素片購(gòu)于江西江中藥業(yè)股份有限公司(每粒0.4 g，編號(hào)：A13202222273)，醋酸鈉林格液購(gòu)于湖南康源制藥有限公司，一抗稀釋液(MDL MD412899)，二抗稀釋液(MDL MD51233)，中等蛋白分子量marker(DA2019)，ZO-1 antibody(MD1502)、Claudin-1antibody(MD2430)、TLR4 antibody(MD2233)、P-JNK antibody(MD3452)，P-P38 antibody(MD7543)均購(gòu)于MDL公司。ELISA試劑盒購(gòu)于上海代軒生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組 取30只SD大鼠數(shù)字法隨機(jī)分為THS未復(fù)蘇組(THS組，n=10)，醋酸鈉林格液復(fù)蘇組(AR組，n=10)，醋酸鈉林格液聯(lián)合乳酸菌復(fù)蘇組(AL組，n=10)，其中AL組大鼠建立休克模型前在正常喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上加服用乳酸菌素片1周(按照體積面積換算，大鼠每次服用劑量108 mg/kg，每天3次)。

1.3 THS模型的建立 將3組大鼠通過(guò)腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉后，將大鼠固定在恒溫手術(shù)臺(tái)，右側(cè)股骨通過(guò)重物墜落撞擊構(gòu)建粉碎性骨折，右側(cè)股動(dòng)脈置管快速放血，左側(cè)股動(dòng)脈置管予以監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP)(測(cè)壓管中預(yù)先應(yīng)用2.5%的枸櫞酸鈉葡萄糖注射液預(yù)防血液凝固)，并于30 min內(nèi)將MAP降至(35±5)mmHg，維持4 h；左側(cè)股靜脈置管后期予以休克復(fù)蘇補(bǔ)液。置管后，大鼠適應(yīng)20 min。THS組、AR組及AL組制作休克模型：用1 mL含有提前填充枸櫞酸鈉溶液0.1 mL注射器從股動(dòng)脈以2 mL/3min速度緩慢放血，直至MAP達(dá)(35±5)mmHg，大概需要20 min，后續(xù)通過(guò)緩慢回輸自體血或少量放血維持MAP在(35±5)mmHg區(qū)間波動(dòng)1 h，THS組不予以液體復(fù)蘇，觀察4 h后取大鼠回腸組織。AR組與AL組在休克維持1 h后，利用醋酸鈉林格液于左側(cè)股靜脈通過(guò)微量泵進(jìn)行限制性液體復(fù)蘇(通過(guò)限制輸入液體的量和靜脈泵入速度，30 min內(nèi)控制65 mmHg≤MAP<70 mmHg，并維持30 min，后繼續(xù)將大鼠復(fù)蘇至正常血壓水平)，復(fù)蘇成功后觀察4 h后處死取大鼠回腸組織置于-80 ℃冰箱保存。本研究嚴(yán)格按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》的建議進(jìn)行，并得到了蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 ELISA法檢測(cè)大鼠外周血TNF-α、IL-6、IL-4、及IL-10含量 按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明，檢測(cè)3組大鼠外周血中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL-6)、IL-4及IL-10含量。

1.4.2 Western blotting法檢測(cè)回腸組織ZO-1、Claudin-1、TLR4、p38磷酸化及JNK磷酸化蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取超低溫冰箱中冷凍的回腸組織，加入裂解液離心30 min獲取上清液，于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。采用BCA試劑檢測(cè)上述蛋白濃度后，經(jīng)SDS-PAGE分離后經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)移電泳轉(zhuǎn)印至PVDF膜。分別加入相應(yīng)一抗在4 ℃孵育過(guò)夜并經(jīng)過(guò)TBST 洗膜3次，再加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后利用TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光、顯影、定影、拍照，最后利用圖像分析軟件Scion Image 對(duì)蛋白帶進(jìn)行吸光度分析。將目的蛋白與β-actin灰度值進(jìn)行比值即為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 回腸組織病理學(xué)檢查 回腸組織在經(jīng)過(guò)10%甲醛溶液內(nèi)固定、石蠟包埋且卡片、HE染色后在光鏡下進(jìn)行小腸組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠體質(zhì)量、基礎(chǔ)MAP比較 經(jīng)單因素方差分析，3組大鼠體質(zhì)量、基礎(chǔ)MAP差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 3組大鼠體質(zhì)量和基礎(chǔ)平均動(dòng)脈壓比較

2.2 3組大鼠外周血細(xì)胞因子含量比較 與THS組相比，AL組大鼠外周血TNF-α、IL-6含量降低，IL-4、IL-10含量升高，AR組TNF-α含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與AR組比較，AL組大鼠外周血TNF-α含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各細(xì)胞因子水平AR組和AL組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 3組大鼠外周血細(xì)胞因子含量比較

2.3 3組大鼠回腸組織ZO-1、Claudin-1、TLR4、p38磷酸化及JNK磷酸化蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 各組回腸組織，與THS組相比，AR組大鼠外周血TLR4、P-P38、P-JNK含量降低，AL組ZO-1、Claudin-1 含量升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與AR組相比，AL組ZO-1、Claudin-1 含量升高，TLR4、P-JNK含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖1、表3)。

表3 3組大鼠回腸組織ZO-1、Claudin-1、TLR4、p38磷酸化及JNK磷酸化蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

2.4 回腸組織病理學(xué)改變 在光鏡下觀察：THS組回腸黏膜完整性破壞，黏膜層可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，絨毛黏膜及黏膜下間質(zhì)水腫明顯，間質(zhì)層可見(jiàn)淤血；AR組較THS組回腸黏膜完整性破壞少，可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下間質(zhì)水腫減輕；AL組回腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，較少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)間質(zhì)淤血表現(xiàn)，間質(zhì)無(wú)明顯水腫(見(jiàn)圖2)。

3 討論

THS病人腸道血流減少導(dǎo)致的腸道菌群移位是介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)的重要因素[8]。本研究的重點(diǎn)是前期應(yīng)用乳酸菌飼養(yǎng)SD大鼠，通過(guò)建立THS模型，觀察利用醋酸鈉林格液限制性液體復(fù)蘇對(duì)大鼠腸黏膜屏障的影響。

THS激發(fā)全身炎癥反應(yīng)包括激活先天免疫反應(yīng)和瀑布樣促炎細(xì)胞因子的釋放,尤其是TLR4在宿主防御病原微生物入侵并識(shí)別與病原相關(guān)分子模式中扮演一個(gè)關(guān)鍵角色[9]。TLR4活化已被證實(shí)在許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括MAPK和NF-κB途徑(這些都是炎癥反應(yīng)激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑)中發(fā)揮重要作用[9-10]。絲裂原激活蛋白激酶(MAPKs)是一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，特別是在介導(dǎo)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放發(fā)揮重要作用。在哺乳動(dòng)物中，MAPK家族的主要成員包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)，其中JNK和p38 MAPK在應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。BARRENSCHEE等[12]研究表明，TLR4激活p38 MAPK上調(diào)了炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，并刺激了炎癥細(xì)胞因子的釋放。既往研究[13]表明，p38 MAPK的激活導(dǎo)致血紅素加氧酶-1(HO-1)在腸組織中產(chǎn)生，早期抑制p38 MAPK活化可能是預(yù)防出血性休克后腸組織損傷和多器官功能衰竭發(fā)展的有效手段，因此，TLR4-p38MAPK/JNK信號(hào)通路介導(dǎo)的THS腸損傷過(guò)程是可行的。

醋酸鈉林格液作為臨床常用的新一代平衡鹽溶液，前期本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)[7，14-15]，醋酸鈉林格液不會(huì)引起乳酸蓄積及較少導(dǎo)致高血糖，而且在THS繼發(fā)重要臟器(心、肝、肺)損傷方面具有保護(hù)作用。然而在腸道損傷方面，目前國(guó)內(nèi)外研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用醋酸鈉林格液限制性復(fù)蘇THS大鼠后，大鼠腸組織病理在光鏡下觀察其腸道的炎性水腫及炎細(xì)胞的浸潤(rùn)較休克不復(fù)蘇組明顯好轉(zhuǎn)，說(shuō)明醋酸鈉林格液對(duì)THS大鼠腸道具有保護(hù)作用。

腸道作為是THS后啟動(dòng)MODS的“中心器官”，腸道損傷后最主要表現(xiàn)為腸黏膜屏障功能障礙，進(jìn)而使腸腔內(nèi)高濃度的細(xì)菌、毒素等通過(guò)受損腸道進(jìn)入門靜脈匯入體循環(huán)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生[16]。乳酸菌最常用的益生菌菌株與病原體競(jìng)爭(zhēng)，通過(guò)其黏附于腸上皮來(lái)增強(qiáng)黏膜屏障完整性，同時(shí)通過(guò)識(shí)別TLR4影響腸道上皮細(xì)胞，這些相互作用可刺激保護(hù)性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，例如IL-10，可以抑制上皮細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)上皮細(xì)胞再生[17]。本研究在建立THS模型前期通過(guò)給大鼠服用乳酸菌素片來(lái)補(bǔ)充乳酸菌，發(fā)現(xiàn)在醋酸鈉林格液聯(lián)合乳酸菌組TLR4、P-P38、P-JNK、TNF-α、IL-6表達(dá)水平較單純應(yīng)用醋酸鈉林格液復(fù)蘇組明顯降低，在常規(guī)液體復(fù)蘇基礎(chǔ)上應(yīng)用乳酸菌可以抑制TLR4-p38MAPK/JNK炎性信號(hào)通路介導(dǎo)的腸損傷，同時(shí)發(fā)現(xiàn)抗炎因子IL-4及IL-10表達(dá)水平增加，也證實(shí)上述觀點(diǎn)。腸上皮細(xì)胞中ZO-1、Claudin-1蛋白相互作用形成緊密連接，保證其腸黏膜屏障的完整性具有重要作用。本研究通過(guò)利用Western blotting檢測(cè)ZO-1蛋白和Claudin-1蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)醋酸鈉聯(lián)合乳酸菌組較單純應(yīng)用醋酸鈉組蛋白表達(dá)水平增加，也進(jìn)一步證實(shí)了乳酸菌在保護(hù)腸黏膜屏障上具有重要作用。

綜上所述，我們推測(cè)在常規(guī)液體復(fù)蘇THS基礎(chǔ)上，應(yīng)用乳酸菌可能進(jìn)一步抑制TLR4-p38MAPK/JNK炎性信號(hào)通路的表達(dá)，進(jìn)而抑制下游促炎因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，同時(shí)增加抗炎因子IL-4和IL-10表達(dá)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)了休克造成的促炎因子和抗炎因子的表達(dá)失衡，減輕了THS腸道損傷，為臨床控制休克病人腸道損傷提供理論基礎(chǔ)，但考慮到Toll樣受體家族龐大，信號(hào)通路復(fù)雜，本研究尚處于初步階段，還需進(jìn)一步大樣本深入探究。