徐家新，李 娟，王 磊，丁周志，周 瑞

毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒時(shí)期常見(jiàn)的下呼吸道感染性疾病，可由多種病毒感染引起，如呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒、腺病毒等[1]，未來(lái)可能發(fā)展為支氣管哮喘。其中僅最常見(jiàn)的RSV感染就可造成每年3 310萬(wàn)次急性發(fā)病、320萬(wàn)次住院治療和11.82萬(wàn)例患兒死亡[2]，且缺乏有效的特異性治療措施，危害極大。毛細(xì)支氣管炎發(fā)病機(jī)制至今未明[3]，目前研究最多的是免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制，其中Th17/Treg失衡參與哮喘的發(fā)病，但是否參與關(guān)于毛細(xì)支氣管炎的研究相對(duì)較少。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是免疫抑制T細(xì)胞，可分泌白細(xì)胞介素(IL)-10和IL-35等免疫抑制因子，對(duì)多種免疫細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。輔助T淋巴細(xì)胞(Th17)是T淋巴細(xì)胞亞群的一種，屬于促炎細(xì)胞，能夠分泌IL-17等發(fā)揮作用，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Th17可能參與毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病機(jī)制和免疫過(guò)程[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)毛細(xì)支氣管炎患兒體內(nèi)Th17、Treg以及相關(guān)細(xì)胞因子的水平，探討Th17/Treg及細(xì)胞因子在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床病情預(yù)判和治療尋找靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我科2019年10月至2020年2月收治的毛細(xì)支氣管炎患兒83例，其中男58例，女25例，年齡3.43(1.97,6.27)個(gè)月。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《兒科學(xué)》人民衛(wèi)生出版社第9版和《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第8版：(1)年齡在2歲以下；(2)以喘息和肺部哮鳴音為臨床特征；(3)胸部X線(xiàn)檢查可見(jiàn)不同程度的肺充氣過(guò)度或斑片狀浸潤(rùn)影，或者支氣管周?chē)准胺渭y理增粗。排除標(biāo)準(zhǔn)：患慢性肺疾病(支氣管肺發(fā)育不良)、先天性呼吸道發(fā)育異常、先天性心臟病、入院前4周應(yīng)用丙種球蛋白和激素史、免疫功能缺陷和神經(jīng)肌肉疾病等。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：BYYFY-2020KY017)，并告知患兒監(jiān)護(hù)人研究相關(guān)情況，簽署相關(guān)知情同意書(shū)。

病例組分組：患兒病情嚴(yán)重程度分組標(biāo)準(zhǔn)參照毛細(xì)支氣管炎診斷、治療與預(yù)防專(zhuān)家共識(shí)(2014年版)[5]。病例組分為輕癥組(42例)、中癥組(21例)和重癥組(20例)。統(tǒng)計(jì)其年齡、性別、住院時(shí)間、出生方式、喂養(yǎng)方式、是否早產(chǎn)。同期健康體檢兒童30名為對(duì)照組，其中男22名，女8名，年齡(4.38±2.84)個(gè)月。2組年齡、性別具有可比性。

1.2 試劑與儀器 HumanTh17/Treg Phenotyping Kit，IgG1-APC(APC標(biāo)記的鼠抗人同型對(duì)照IgG1)，IgG1-PE(PE標(biāo)記的鼠抗人同型對(duì)照IgG1)，溶血素、Foxp3固定/破膜劑、刺激劑/蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑、RPMI1640培養(yǎng)液采購(gòu)自美國(guó)BD公司。檢測(cè)儀器FACS Canto流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。IL-6、IL-10、IL-17和IL-35試劑采購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。血常規(guī)檢測(cè)儀器希森美康XT-4000i。C反應(yīng)蛋白(CRP)檢測(cè)儀器自動(dòng)生化分析儀COBAS8000。降鈣素原(PCT)檢測(cè)儀器免疫定量分析儀QMT8000，肝素結(jié)合蛋白(HBP)檢測(cè)儀器Jetistar 3000。

1.3 方法 2組均于清晨采集空腹外周血靜脈血3 mL行血常規(guī)、Treg、Th17、IL-6、IL-10、IL-17和IL-35檢測(cè)，病例組另外采集外周血3 mL檢測(cè)CRP、PCT、HBP。

流式細(xì)胞檢測(cè)：抽取所有研究對(duì)象外周血各500 μL于試管中，用于流式細(xì)胞檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞。

剩余外周血離心，分離血漿，-80 ℃保存，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并得到直線(xiàn)回歸方程，將樣品的吸光度值代入方程，計(jì)算出IL-6、IL-10、IL-17和IL-35的水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)。偏態(tài)分布計(jì)量資料以M(P25,P75)描述，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Mann-WhitneyU檢驗(yàn)及Pearman相關(guān)分析和logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和病例組一般資料及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的比較 病例組各組Th17、Th17/Treg、IL-6、IL-17較對(duì)照組升高，而Treg、IL-6、IL-10較對(duì)照組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);性別、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP、PCT、HBP各組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1～2)。

表1 對(duì)照組和病例組之間一般資料比較[M(P25,P75)]

2.2 病例組間各組相關(guān)指標(biāo)比較 重癥組Th17、Th17/Treg、IL-6、IL-17較中癥組和輕癥組均增高，Treg、IL-10、IL-35較輕癥組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中癥組和輕癥組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CRP、PCT、HBP、住院時(shí)間、早產(chǎn)率、剖宮產(chǎn)率、喂養(yǎng)方式各組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2～3)。

表2 對(duì)照組和病例組之間各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較[M(P25,P75)]

2.3 病例組Th17、Treg和細(xì)胞因子間Pearson相關(guān)分析 病例組Th17與Th17/Treg、IL-17、IL-6呈正相關(guān)，與IL-35呈負(fù)相關(guān)；Treg與IL-10、IL-35呈正相關(guān)，與Th17/Treg負(fù)相關(guān);Th17/Treg與IL-17、IL-6之間呈正相關(guān)，與IL-10、IL-35負(fù)相關(guān)；IL-17與IL-6呈正相關(guān)，與IL-35呈負(fù)相關(guān)(P<0.05～P<0.01)(見(jiàn)表4)。

表4 Th17、Treg及相關(guān)細(xì)胞因子之間相關(guān)性分析

2.4 重癥毛細(xì)支氣管炎的危險(xiǎn)因素分析 以重癥、非重癥為因變量，Th17/Treg、IL-17、IL-6、IL-10、IL-35為自變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析,結(jié)果顯示Th17/Treg、IL-17和IL-6是毛細(xì)支氣管炎的重癥危險(xiǎn)因素(P<0.05～P<0.01)(見(jiàn)表5)。

表5 重癥毛細(xì)支氣管炎危險(xiǎn)因素logistic回歸分析

3 討論

毛細(xì)支氣管炎是以喘息、吸氣性三凹征、肺部可聞及哮鳴音和細(xì)濕啰音為主要臨床特征的急性下呼吸道感染疾病，在6月齡以下的嬰兒中具有較高病死率，病理生理以中性粒細(xì)胞快速浸潤(rùn)、黏液分泌過(guò)多和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)延遲為特征，其中RSV感染最為常見(jiàn)。有研究[6]發(fā)現(xiàn)人RSV毛細(xì)支氣管炎患兒發(fā)展為哮喘的概率約為正常患兒的3倍。關(guān)于毛細(xì)支氣管炎的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但存在多種免疫異常反應(yīng)，且與哮喘的發(fā)病有著相似的免疫學(xué)機(jī)制，其中Th17/Treg失衡被認(rèn)為可能是其主要發(fā)病機(jī)制。

表3 病例組間臨床資料和實(shí)驗(yàn)指標(biāo)比較[M(P25,P75)]

Th17和Treg細(xì)胞均是輔助T細(xì)胞家族中的成員，Th17主要起到促炎的作用，而Treg是抑制免疫的調(diào)節(jié)細(xì)胞，它們?cè)诜只舷嗷マ卓?，功能上相互?duì)立，Th17/Treg的平衡對(duì)機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)起到重要的作用。Th17細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子如IL-17、IL-6、IL-22等參與炎癥反應(yīng)，其中最主要的效應(yīng)因子是IL-17，通過(guò)誘導(dǎo)其他炎性細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的局部浸潤(rùn)，從而引起組織損傷。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中[7]，有學(xué)者在RSV感染的小鼠肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)IL-17明顯增高，并引起氣道內(nèi)黏液分泌增加。IL-17通過(guò)直接上調(diào)人氣管和支氣管上皮細(xì)胞株中黏液基因MUC5B的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)黏液的產(chǎn)生。Th17在CD8+T淋巴細(xì)胞上與IL-17RA結(jié)合，從而導(dǎo)致IL-17的產(chǎn)生，削弱了它們降低病毒載量和減少肺部感染細(xì)胞數(shù)量的能力。中和抗IL-17抗體可減少黏液分泌和IL-13的產(chǎn)生并增加病毒清除的能力，進(jìn)一步支持了過(guò)量IL-17在促進(jìn)病理中的作用[8]。袁林等[9]對(duì)比了健康兒童和毛細(xì)支氣管炎患兒體內(nèi)細(xì)胞因子的變化，結(jié)果顯示毛細(xì)支氣管炎患兒血清IL-17較對(duì)照組增高，研究說(shuō)明Th17和IL-17的促炎作用在毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病和疾病發(fā)展中起著重要的作用。而IL-6在Th17的分化調(diào)控中起著重要的作用。感染促使機(jī)體分泌大量IL-6，與TGF-β協(xié)同激活Th17分化的關(guān)鍵因子維甲酸類(lèi)孤核受體γt(RORγt)，誘導(dǎo)Th17增殖[10]。過(guò)度分化的Th17繼續(xù)分泌IL-6和IL-17，使得機(jī)體免疫進(jìn)一步失衡，加劇炎癥反應(yīng)。在本研究的結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎患兒Th17比例、IL-6和IL-17較對(duì)照組增高，重癥組較輕癥組增高，與以上研究結(jié)果大致相同，并且三者之間相互呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明毛細(xì)支氣管炎患兒體內(nèi)Th17及其細(xì)胞因子明顯增高，抑制病毒清除和加劇炎癥，重癥病例更加明顯。

Treg細(xì)胞不僅抑制過(guò)度增生和病理性T細(xì)胞反應(yīng)，而且限制Th2型免疫反應(yīng)，并對(duì)新生小鼠的病毒增殖起抑制作用[11]。因此，Treg細(xì)胞不僅能在RSV感染期間驅(qū)動(dòng)適當(dāng)?shù)目共《痉磻?yīng)，而且能抑制疾病的發(fā)展。在缺乏Treg的小鼠體內(nèi)形成的過(guò)度炎癥環(huán)境可直接導(dǎo)致T效應(yīng)細(xì)胞異?；罨?，并將其歸巢到呼吸道外的多種組織部位，從而延長(zhǎng)病程[12]。Tregs可以通過(guò)直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸阻斷TCR信號(hào)和IL-2信號(hào)來(lái)抑制傳統(tǒng)的T細(xì)胞增殖[13]，還可以產(chǎn)生IL-10和TGF-β來(lái)抑制其他T細(xì)胞亞群的發(fā)育和功能。其中IL-10可抑制RSV感染小鼠的疾病和炎癥，研究[14]發(fā)現(xiàn)IL-10是控制急性病毒性肺感染炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵，IL-10缺乏小鼠的T細(xì)胞不能自我調(diào)節(jié)IFN-γ的產(chǎn)生，這可能導(dǎo)致IL-10缺乏小鼠RSV感染后期免疫損傷的加劇。IL-35是IL-12異二聚體細(xì)胞因子家族的新成員，可通過(guò)抑制Th2相關(guān)細(xì)胞因子，如IL-17 等的產(chǎn)生，限制Th2細(xì)胞增殖，從而逆轉(zhuǎn)Th2細(xì)胞依賴(lài)性氣道高反應(yīng)。Treg 細(xì)胞主要通過(guò)產(chǎn)生IL-35，將Th17細(xì)胞阻滯在G1期，而不是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制Th17細(xì)胞分化和IL-17因子釋放來(lái)發(fā)揮免疫抑制作用，并具有誘導(dǎo)iTr35(IL-35誘導(dǎo)的CD4+Treg細(xì)胞)增殖的能力[15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中小鼠體內(nèi)IL-35水平升高可顯著誘導(dǎo)Treg細(xì)胞和Th2增強(qiáng)，而體外研究提供了相似的結(jié)果，提示IL-35對(duì)T細(xì)胞亞群的進(jìn)化具有免疫抑制作用。IL-35顯著抑制CD4+T細(xì)胞增殖和IL-2釋放，增加Treg細(xì)胞和IL-10[16]。臨床研究中，唐艷麗等[17]發(fā)現(xiàn)毛細(xì)支氣管炎患兒Treg細(xì)胞比例以及血清IL-4、IL-10水平在治療前明顯低于對(duì)照組，治療后較前明顯升高。本研究與其研究結(jié)果基本一致，Treg、IL-10、IL-35在病例組和對(duì)照組間有差異，病例組明顯降低，重癥組愈加顯著，說(shuō)明Treg增殖抑制和IL-10、IL-35的分泌減少在本病的免疫機(jī)制中起著重要的作用。IL-35與Th17/Treg、Th17和IL-17呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明IL-35可能是抑制Th17和IL-17的重要因子。通過(guò)logistic回歸分析，我們探討了重癥與輕癥毛細(xì)支氣管炎相關(guān)因素，最終發(fā)現(xiàn)Th17/Treg、IL-17和IL-6是毛細(xì)支氣管炎發(fā)展為重癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，Th17/Treg免疫失衡，特別是Th17及其分泌的促炎因子IL-17、IL-6的過(guò)度增殖和分泌降低了機(jī)體對(duì)病毒清除能力，氣道內(nèi)黏液增多，炎癥反應(yīng)加劇，可能是導(dǎo)致毛細(xì)支氣管炎患兒病情的加重并延長(zhǎng)住院時(shí)間的重要因素。而IL-35可能是抑制Th17和IL-17的細(xì)胞因子，成為一種針對(duì)毛細(xì)支氣管炎免疫失衡新的治療和預(yù)防策略。