李玲玲，蘇 磊，胡夢(mèng)圓，張昕雨，魯 藝

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

慢性疲勞綜合征是一種涉及全身臟器，影響人們生活質(zhì)量的復(fù)雜疾病，本病發(fā)生多與慢性應(yīng)激相關(guān)[1-2]。近年來(lái)，慢性疲勞綜合征的發(fā)病率越來(lái)越高[3]，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為主要涉及能量代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、遺傳因素等，線粒體動(dòng)力學(xué)對(duì)細(xì)胞能量代謝具有重要的意義[4-5]。西醫(yī)對(duì)此尚無(wú)令人滿意的治療方法，中醫(yī)治療此病的優(yōu)勢(shì)日益顯現(xiàn)。中醫(yī)學(xué)將慢性疲勞綜合征歸屬于“虛勞”“郁證”范疇[6]。臨床研究[7]結(jié)果表明，升陽(yáng)散火湯可以顯著改善CFS患者的癥狀和抑郁狀態(tài)，但升陽(yáng)散火湯治療慢性疲勞綜合征的機(jī)制尚不明確。其具體機(jī)制和拆方后的各個(gè)組合的抗疲勞作用尚值得進(jìn)一步探討。本研究采用冰水游泳、慢性束縛、夾尾復(fù)合方法構(gòu)建慢性疲勞小鼠模型，從線粒體動(dòng)力學(xué)的角度，探討升陽(yáng)散火湯及其拆方對(duì)慢性疲勞小鼠行為學(xué)及骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響，以期明確慢性疲勞小鼠的線粒體損傷情況及升陽(yáng)散火湯及其拆方的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性ICR 小鼠50 只，體質(zhì)量（20±2）g，SPF 級(jí)，5～6 周齡，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（京）2016-0006。完全按照動(dòng)物中心飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，SPF 級(jí)環(huán)境，溫度18～25℃，自由攝食和飲水，定期觀察小鼠生長(zhǎng)狀況，及時(shí)更換墊料并定時(shí)給藥。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。動(dòng)物倫理號(hào)：BUCM -4 -2021030301-1017

1.2 藥物制備 升陽(yáng)散火湯所含藥味生甘草（批號(hào)20022551）每袋24 g，相當(dāng)于飲片120 g；防風(fēng)（批號(hào)20008401）每袋12 g，相當(dāng)于飲片120 g；升麻（批號(hào)20007371）每袋16 g，相當(dāng)于飲片160 g；葛根（批號(hào)19029601）每袋16 g，相當(dāng)于飲片160 g；獨(dú)活（批號(hào)20009871）每袋32 g，相當(dāng)于飲片160 g；白芍藥（批號(hào)20020801）每袋8 g，相當(dāng)于飲片160 g；羌活（批號(hào)20005711）每袋16，g 相當(dāng)于飲片160 g；人參（批號(hào)20008481）每袋32 g，相當(dāng)于飲片160 g；柴胡（批號(hào)20022891）每袋20 g，相當(dāng)于飲片200 g；炙甘草（批號(hào)20018851）每袋24 g，相當(dāng)于飲片120 g。取相當(dāng)于飲片等量的各味藥顆粒劑，混合后，用100 ℃蒸餾水配制成升陽(yáng)散火湯水溶液備用。配方顆粒均由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室進(jìn)行質(zhì)量控制檢測(cè)。

1.3 試劑及儀器

1.3.1 試劑BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：PC0020）、RIPA裂解液（貨號(hào)：R0020）、預(yù)染蛋白marker（貨號(hào)：PR1920）、PVDF膜（貨號(hào)：IPVH00010）、Super ECL Plus 升級(jí)版超敏發(fā)光液（貨號(hào)：P1010），均購(gòu)于北京拜爾迪生物科技有限公司；GAPDH（貨號(hào)TA-08）、DRP1 Rabbit Antibody（貨號(hào)：YT1414）、MFN1 Rabbit Antibody（貨號(hào)YN3054）、OPA1 Rabbit Antibody（貨號(hào)：YN2976）均購(gòu)于Proteintech 公司；TEMED（貨號(hào)：T8133）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（貨號(hào)：ZB-2301）、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（貨號(hào)：134560）均購(gòu)于北京百諾威生物科技有限公司。

1.3.2 儀器 MIKRO 22R 低溫冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hettich 公司），TEM-1400plus 透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社），VE-180 電泳儀及電轉(zhuǎn)儀（上海Tanon 科技有限公司），MULTISKAN MK3 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司），610C 凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司），SKY-200B 搖床（上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型制備 采用數(shù)字隨機(jī)分組法將ICR 小鼠分為5組，即空白組、模型組、升陽(yáng)散火湯全方組（生甘草、防風(fēng)、升麻、葛根、獨(dú)活、白芍、羌活、人參、柴胡、炙甘草）、補(bǔ)虛組（人參、芍藥、生甘草、炙甘草），升陽(yáng)散郁組（升麻、葛根、柴胡、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活），每組10 只。除空白組外，采用單日進(jìn)行束縛和力竭游泳，雙日進(jìn)行夾尾和束縛[8]復(fù)制慢性疲勞動(dòng)物模型，在整個(gè)試驗(yàn)期間保持造模。

1.4.2 給藥方法 升陽(yáng)散火湯按照 《內(nèi)外傷辨惑論》原方中記載的用量為升麻、葛根、獨(dú)活、羌活、白芍藥、人參（以上各五錢），甘草（炙）、柴胡（以上各三錢），防風(fēng)（二錢五分），甘草（生，二錢）通過(guò)度量衡換算，金代一兩約為現(xiàn)代 40 g，1 兩=10 錢=100 分，據(jù)此折算為現(xiàn)代劑量進(jìn)行制備（升麻、葛根、獨(dú)活、羌活、白芍藥、人參各20 g，炙甘草、柴胡各12 g，防風(fēng)10 g，生甘草8 g），按照小鼠與人的體表面積及原藥與顆粒劑比例折算小鼠的用藥劑量，升陽(yáng)散火湯組給藥劑量為 2.73 g/kg、升陽(yáng)散郁組給藥劑量為 1.57 g/kg、補(bǔ)虛組給藥劑量為 1.16 g/kg，每日1 次，連續(xù)灌胃4 周。

1.4.3 行為學(xué)測(cè)試 所有小鼠在造模第15 天、30 天、45 天進(jìn)行稱質(zhì)量記錄以及力竭游泳實(shí)驗(yàn)和懸尾靜止實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 超微結(jié)構(gòu)觀察 第45 天后，每組隨機(jī)各取3 只取材，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后于右側(cè)后肢分離骨骼肌（腓腸?。〖s1 mm×1 mm×3 mm 大小組織塊。將取下骨骼肌標(biāo)本置于3%戊二醛溶液中繼續(xù)固定48 h 后，進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片，采用透射電子顯微鏡TEM-1400 plus觀察骨骼肌的肌絲形態(tài)及線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4.5 Western blotting 分析 提取各組小鼠骨骼肌線粒體蛋白并用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，配制10%分離膠及濃縮膠，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳（80 V 30 min，120 V 60 min），濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（180 mA 90 min，0.45 μm 孔徑PVDF 膜），5%脫脂牛奶封閉120 min后孵一抗4℃過(guò)夜，所用抗體為β-actin（1:30 000）、DRP1（1:500）、OPA1（1:1 000）、MFN1（1:500）。次日37 ℃孵二抗60 min，TBST 清洗3 次用ECL 化學(xué)發(fā)光液顯色并進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。所有數(shù)據(jù)先經(jīng)過(guò)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊采用多組單因素方差分析（One-way ANOVO），組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis）。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 升陽(yáng)散火湯及其拆方對(duì)慢性疲勞小鼠行為學(xué)的影響

2.1.1 對(duì)慢性疲勞小鼠體質(zhì)量的影響 與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢（P＜0.05）；給藥干預(yù)15、30 d 后與模型組比較，各組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 升陽(yáng)散火湯及其拆方對(duì)慢性疲勞小鼠體質(zhì)量的影響（，n =10） g

表1 升陽(yáng)散火湯及其拆方對(duì)慢性疲勞小鼠體質(zhì)量的影響（，n =10） g

注：與正常組比較，# P ＜0.05

2.1.2 對(duì)慢性疲勞小鼠力竭游泳時(shí)間的影響 各組小鼠造模15 d后，與正常組比較，模型組、升陽(yáng)散火湯組、升陽(yáng)散郁組、補(bǔ)虛組各組小鼠力竭游泳時(shí)間明顯減少（P＜0.05）；給藥干預(yù)15 d 后，與模型組比較，升陽(yáng)散火湯組、補(bǔ)虛組力竭游泳時(shí)間明顯升高（P＜0.05）其中以補(bǔ)虛組的效果最明顯；給藥干預(yù)30 d 后與模型組比較，升陽(yáng)散火湯組、補(bǔ)虛組、升陽(yáng)散郁組力竭游泳時(shí)間均顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2

表2 升陽(yáng)散火湯及其拆方對(duì)慢性疲勞小鼠力竭游泳時(shí)間的影響（，n =10） min

表2 升陽(yáng)散火湯及其拆方對(duì)慢性疲勞小鼠力竭游泳時(shí)間的影響（，n =10） min

注：與正常組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.1.3 對(duì)慢性疲勞小鼠懸尾靜止時(shí)間的影響 各組小鼠造模15 d 后，與正常組比較，模型組、升陽(yáng)散火湯組、升陽(yáng)散郁組、補(bǔ)虛組各組小鼠懸尾靜止時(shí)間明顯增加（P＜0.05）；給藥干預(yù)15 d 后，與模型組比較，升陽(yáng)散火湯組、升陽(yáng)散郁組小鼠懸尾靜止時(shí)間縮短（P＜0.05）；給藥干預(yù)30 d 后，與模型組比較，升陽(yáng)散火湯組及其拆方各組小鼠懸尾靜止時(shí)間縮短（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 升陽(yáng)散火湯及其拆方對(duì)慢性疲勞小鼠懸尾靜止時(shí)間的影響（，n =10）

表3 升陽(yáng)散火湯及其拆方對(duì)慢性疲勞小鼠懸尾靜止時(shí)間的影響（，n =10）

注：與正常組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.2 骨骼肌超微電鏡結(jié)果 空白組小鼠骨骼肌肌絲排列整齊，線粒體形狀規(guī)則，呈橢圓形，膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)嵴清晰。模型組小鼠骨骼肌線粒體形狀不規(guī)則，膜溶解并相互連接，內(nèi)嵴溶解缺失明顯，排列紊亂。全藥組小鼠骨骼肌肌節(jié)清晰，線粒體形態(tài)接近空白組，多呈橢圓形，膜結(jié)構(gòu)較完整。升陽(yáng)散郁組骨骼肌恢復(fù)程度不及升陽(yáng)散火湯組，小鼠骨骼肌肌絲肌節(jié)欠清晰，明暗帶差異不明顯，線粒體多呈腫脹狀態(tài)，基質(zhì)變淺。補(bǔ)虛組肌節(jié)欠清晰，部分肌絲溶解，線粒體恢復(fù)程度優(yōu)于升陽(yáng)散郁組。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠線粒體電鏡觀察結(jié)果

2.3 Western blotting 結(jié)果 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組線粒體融合相關(guān)蛋白MFN1、OPA1，線粒體分裂相關(guān)蛋白DRP1 表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，升陽(yáng)散火湯組、補(bǔ)虛組、升陽(yáng)散郁組OPA1 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01），MFN 1 蛋白表達(dá)水平有上調(diào)趨勢(shì)；升陽(yáng)散火湯組、升陽(yáng)散郁組DRP1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），補(bǔ)虛組DRP1 蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 MFN1、OPA1、DRP1 蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

慢性疲勞綜合征病程較長(zhǎng)，病性以虛為主，或因虛致實(shí)，虛實(shí)夾雜。本研究從氣虛生郁，郁而生熱，內(nèi)熱耗傷氣血的角度，選擇升陽(yáng)散火湯及其拆方進(jìn)行慢性疲勞的研究。升陽(yáng)散火湯出自李東垣《內(nèi)外傷辨惑論·卷中》“暑傷胃氣論”篇，是李東垣“火郁發(fā)之”之作，醫(yī)方考載“升麻、柴胡、羌活、獨(dú)活、防風(fēng)、干葛，皆辛溫上行之物也，故用之以升少陽(yáng)之氣，清陽(yáng)既出上竅，則濁陰自歸下竅，而食物傳化自無(wú)抑遏之患；芍藥味酸，能瀉土中之木；人參味甘，能補(bǔ)中州之氣；生甘草能瀉郁火于脾，從而炙之，則健脾胃而和中矣”，其補(bǔ)氣藥與風(fēng)藥結(jié)合，既可補(bǔ)而不滯，又可散而無(wú)傷，補(bǔ)中升陽(yáng)，相須為用，被認(rèn)為是中醫(yī)治法中“升陽(yáng)散火”法的代表方。根據(jù)“法依病機(jī)、拆方依法”的拆方研究思路，可將升陽(yáng)散火湯方拆分為兩大方群，即一為補(bǔ)脾土，生氣血（人參、白芍藥、生甘草、炙甘草）；二為升清陽(yáng)，散郁火（升麻、葛根、柴胡、羌活、防風(fēng)、獨(dú)活）。

慢性疲勞綜合征是一個(gè)漸進(jìn)過(guò)程，目前對(duì)于此疾病的動(dòng)物模型構(gòu)建缺乏統(tǒng)一的制定標(biāo)準(zhǔn)，我們?cè)诓殚喆罅抠Y料后發(fā)現(xiàn)，采用復(fù)合因素建立慢性疲勞動(dòng)物模型更接近于慢性疲勞綜合征患者的臨床表現(xiàn)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)激15 d 后，模型組小鼠較空白組的體質(zhì)量及游泳時(shí)間明顯下降，懸尾靜止時(shí)間有增長(zhǎng)趨勢(shì)，表明本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的疲勞動(dòng)物模型符合慢性疲勞綜合征的主要行為學(xué)特點(diǎn)[12]。

從建模第2 周開(kāi)始，慢性疲勞綜合征小鼠體質(zhì)量明顯增長(zhǎng)緩慢，與文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]一致，說(shuō)明束縛和強(qiáng)迫游泳可能造成小鼠產(chǎn)生類似慢性疲勞綜合征患者體形消瘦的癥狀。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中升陽(yáng)散火湯及其拆方各組小鼠體質(zhì)量結(jié)果與模型組無(wú)差異，提示升陽(yáng)散火湯及其拆方并不能增加慢性疲勞患者的體質(zhì)量。力竭游泳時(shí)間被大多數(shù)研究者認(rèn)為是能夠反映出動(dòng)物體力情況和衡量機(jī)體疲勞程度的經(jīng)典指標(biāo)[16]。根據(jù)動(dòng)物研究表明，升陽(yáng)散火湯全方及拆方均可延長(zhǎng)小鼠游泳至力竭的時(shí)間，且短期內(nèi)（給藥2 周）補(bǔ)虛組效果更佳，長(zhǎng)期（給藥4 周）的慢性疲勞升陽(yáng)散火湯全方效果更佳。提示長(zhǎng)期慢性疲勞患者當(dāng)以補(bǔ)虛與升陽(yáng)散郁結(jié)合治療的中醫(yī)思路。在給藥2 周時(shí)，補(bǔ)虛組對(duì)力竭游泳的指標(biāo)改善作用優(yōu)于升陽(yáng)散火湯組和升陽(yáng)散郁組，進(jìn)一步提示短期慢性疲勞患者使用補(bǔ)虛法，可以起到最佳治療效果。尾懸實(shí)驗(yàn)不僅能體現(xiàn)出小鼠的體力情況，還能體現(xiàn)出小鼠的情緒狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠懸尾靜止時(shí)間長(zhǎng)于正常小鼠，與文獻(xiàn)[13-15]報(bào)道一致。提示模型組小鼠體力下降，心理絕望感增加，升陽(yáng)散火湯治療30 d 后慢性疲勞小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著減少，提示升陽(yáng)散火湯治療后的小鼠體力較好，心理適應(yīng)性較強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)研究采用透射電鏡觀察疲勞對(duì)于小鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)損傷，發(fā)現(xiàn)慢性疲勞小鼠的骨骼肌及線粒體損傷嚴(yán)重，不易恢復(fù)，升陽(yáng)散火湯可更好地保護(hù)骨骼肌及其線粒體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組線粒體融合相關(guān)蛋白OPA1、MFN1，線粒體分裂相關(guān)蛋白DRP1 表達(dá)量顯著下降，表明慢性疲勞可抑制小鼠骨骼肌線粒體分裂和融合，引起線粒體功能障礙。各給藥組線粒體融合、分裂相關(guān)蛋白均有不同程度的調(diào)節(jié)，表明升陽(yáng)散火湯及其拆方均可調(diào)控線粒體分裂和融合，增強(qiáng)線粒體功能以滿足機(jī)體對(duì)能量的需求。

本研究結(jié)果表明，升陽(yáng)散火湯及其拆方均具有提高小鼠抗疲勞能力。但從長(zhǎng)期給藥治療的角度，單獨(dú)補(bǔ)虛或者升陽(yáng)散郁抗慢性疲勞效果均較整方差，提示李東垣升陽(yáng)散火的治療思想對(duì)慢性疲勞綜合征的臨床治療具有實(shí)際意義。