孫秀萍，張曉萌，盧 聰，李翊華，劉新民

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類動物模型三級實驗室，北京 100021；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 藥理毒理中心，北京 100193； 3.中國人民公安大學(xué)醫(yī)院，北京 100038； 4. 北京經(jīng)緯華清醫(yī)療設(shè)備科技公司， 北京 100101)

懸尾實驗，是一種抗抑郁藥物活性篩選非常靈敏的行為學(xué)檢測方法[1]，也可用于抑郁癥病理生理機制的研究[2]。因其快速、方便，自1985年提出至今，被廣為接受和應(yīng)用[3]。該實驗是將動物頭部向下懸掛，動物為克服不正常體位，首先產(chǎn)生以逃避為導(dǎo)向的劇烈掙扎運動，在經(jīng)過努力仍不能擺脫困境后，出現(xiàn)間斷性不動，顯示“行為絕望”狀態(tài)。絕大多數(shù)抗抑郁藥物都可以減少動物懸尾不動時間，而且作用與臨床療效顯著相關(guān)[4]。

早期懸尾實驗，以人工計時居多，工作量大，客觀性不強，不能定量分析動物的掙扎強度。隨著信息、計算機、電子工程等技術(shù)和藥理學(xué)的交叉融合，其自動化測量方法也逐漸發(fā)展起來。目前，國內(nèi)外懸尾測試儀的原理有3種，包括力傳感器、視頻測量及紅外熱釋電原理。國內(nèi)產(chǎn)品以視頻測量居多。視頻測量原理固然提供了更為直觀的顯示界面，但其測量誤差不容忽視，尤其實驗動物增至2只以上，視頻跟蹤的不準確性尤為突出。紅外熱釋電原理易受外界環(huán)境溫度和動物運動狀態(tài)的影響，外界環(huán)境溫度過低或動物運動遲緩時，經(jīng)常出現(xiàn)誤判現(xiàn)象，導(dǎo)致結(jié)果不準確。國外產(chǎn)品大多為傳感器原理[5]。該原理具有更高的靈敏性和準確性。除“不動時間”這一指標外，動物的掙扎強度也成為抗抑郁藥效的評價指標之一。國外文獻經(jīng)常用“功”值表示動物的掙扎強度[1]。與視頻及熱釋電原理相比，傳感器原理唯一可通過“功”指標對動物掙扎強度進行定量分析。國外產(chǎn)品均價格不菲，以測試6個樣本為例，價格在15～23萬人民幣不等。盡管國內(nèi)懸尾儀器市場巨大，但價格因素大大限制了國外產(chǎn)品在國內(nèi)的廣泛應(yīng)用?；谝陨显?，我們采用力傳感器原理，研制了懸尾實驗實時檢測分析處理系統(tǒng)，在硬件上進行了改進，實現(xiàn)了懸尾實驗的自動化，指標敏感而且豐富，滿足了多樣本篩選的需求，現(xiàn)已應(yīng)用于抗抑郁藥物的篩選[6]。

1 材料和方法

1.1 硬件研制所需器材

計算機(9寸以上寬屏液晶顯示，奔騰雙核1.6G Hz以上，內(nèi)存1G以上，40 G及其以上硬盤，三個以上USB接口，刻錄光驅(qū))；測試箱(灰白色鋁合金材料)；傳感器；數(shù)據(jù)傳輸線，采集傳輸盒。

1.2 藥品

帕羅西汀 (paroxetine) 購自中國食品藥品檢定研究院提供，批號為100357-200301；丙咪嗪 (imipramine) 購自Sigma 公司，批號為010M01291V。上述藥物均于實驗前用蒸餾水溶解備用。

1.3 實驗動物

雄性C57BL/6J小鼠，20～24 g，SPF級，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物許可證號【SCXK(京)2004-0001】。動物使用許可證號：SYXK( 京) 2008-0019。動物自由進食進水，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律。動物適應(yīng)環(huán)境一周進行實驗。

1.4 實驗方法

1.4.1 硬件

采用力傳感器原理，采集動物在懸掛過程中產(chǎn)生的張力變化。懸尾箱的設(shè)計，考慮采集自然光線，并最大程度避免周圍環(huán)境對動物的干擾。在滿足技術(shù)和空間需求的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)多樣本檢測。力求實現(xiàn)實驗動物同時懸掛的自動化，節(jié)省人力，并保證實驗數(shù)據(jù)的客觀性。

1.4.2 軟件

建立反映樣本活動程度的數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及實時顯示處理技術(shù)。實驗完成，每個樣本的實驗數(shù)據(jù)和分析結(jié)果按二進制文件格式保存。除統(tǒng)計樣本的運動參數(shù)(運動時間和不動時間)外，本系統(tǒng)提出“功”的概念，采用特定測量方法和數(shù)據(jù)處理算法，使之真實反應(yīng)動物的掙扎程度。

1.4.3 懸尾實驗實時檢測分析處理系統(tǒng)評價指標的驗證

1.4.3.1 運動閾值的確認和數(shù)據(jù)準確性驗證

C57BL/6J雄性小鼠50只，在測試房間適應(yīng)1 h后，進行懸尾實驗。將膠布粘在小鼠尾端1 cm處，再通過膠布，將小鼠懸掛于傳感器下方的掛鉤上。檢測懸尾箱、懸尾控制單元及計算機的連接，開啟計算機，打開懸尾測試軟件，進行實驗各項參數(shù)設(shè)置，將實驗時間設(shè)為6 min。通過調(diào)節(jié)固定手柄，降低橫梁，將動物呈半懸掛狀態(tài)懸掛，升高橫梁，動物呈完全懸掛狀態(tài)，點擊采集按鈕，開始實驗。運動閾值取16.8、26.8、36.8三個值，同時進行人工不動時間的統(tǒng)計。采用SPSS 16.0，首先觀察散點圖是否存在線性相關(guān)，再進行相關(guān)分析。

1.4.3.2 抗抑郁陽性藥對“不動時間”及“功”指標的驗證

圖1 懸尾實驗實時檢測分析處理系統(tǒng)示意圖

C57BL/6J小鼠隨機分為3組，即空白對照組(蒸餾水)、帕羅西汀組(10 mg/kg)、丙咪嗪組(10 mg/kg)，每組10只。各組均給予0.2 mL/10g，單次給藥后 1 h 進行懸尾實驗。實驗方法同1.4.3.1。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。結(jié)果以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。采用單樣本K-S檢驗進行正態(tài)分布檢驗，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，不滿足正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。組間差異采用LSD(方差齊)或 Games-Howell(方差不齊)法，P< 0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 懸尾實驗實時檢測分析處理系統(tǒng)的建立

2.1.1 測試箱：測試箱由8個懸尾箱組成，尺寸為72× 36×16 cm(長×寬×高)。懸尾箱采用灰白色鋁合金材料制成，尺寸為18×18×16 cm (長×寬×高)。懸尾箱采用四周封閉、頂面開放的形式，既可避免周圍環(huán)境干擾，又可采集自然光線。懸尾箱體設(shè)計緊湊，節(jié)省空間。通過旋轉(zhuǎn)固定手柄，調(diào)節(jié)懸尾桿高度，實現(xiàn)多樣本同時懸掛。開始實驗前，將懸尾桿降至最低，動物通過掛鉤懸掛于傳感器下方，此時，動物前肢著地，處于半懸掛狀態(tài)。所有動物懸掛完畢后，調(diào)節(jié)固定手柄，使懸尾桿上升至所需高度，此時，所有動物同時處于完全懸掛狀態(tài)。懸尾實驗實時檢測分析處理系統(tǒng)見圖1。

圖2 信號采集傳輸示意圖

圖3懸尾實驗實時檢測分析處理系統(tǒng)軟件界面圖

2.1.2 傳感器與信號調(diào)理單元：8個傳感器固定于橫梁兩側(cè)，分別對應(yīng)8個懸尾箱。傳感器的輸出經(jīng)過增益調(diào)整、濾波處理送至采集傳輸盒。

2.1.3 采集傳輸裝置：

采集傳輸盒采集信號調(diào)理單元的輸出信號，數(shù)字化后送往PC機。采集傳輸過程如下(圖2)

2.2 軟件設(shè)計

軟件系統(tǒng)包括實驗基本參數(shù)設(shè)置、實驗數(shù)據(jù)采集和實驗數(shù)據(jù)分析三大部分。

實驗基本參數(shù)設(shè)置完成后，開始實驗。軟件讀取數(shù)字化處理后的原始數(shù)據(jù)，以波形及數(shù)字的形式，實時顯示八只懸尾小鼠的運動時間和不動時間。本系統(tǒng)除了可以提取傳統(tǒng)指標“不動時間”外，還可以提取“功”值，用于反應(yīng)動物的掙扎強度。實驗結(jié)果以Excel的形式生成，便于用戶在Excel、SPSS、SAS等分析統(tǒng)計軟件中作進一步分析處理。同時，軟件可進行波形回放；閾值可調(diào)，從而實現(xiàn)結(jié)果再分析。軟件界面圖如圖3所示。

2.3 懸尾實驗實時檢測分析處理系統(tǒng)評價指標的驗證

2.3.1 運動閾值的確認和數(shù)據(jù)準確性驗證

運動閾值為16.8、26.8、36.8時，人工計時與懸尾測試軟件的相關(guān)系數(shù)見表1。當運動閾值為26.8時，人機相關(guān)系數(shù)(person correlation)最大，為0.94，雙側(cè)P=0.000，具有統(tǒng)計學(xué)意義。對此進行了10余次數(shù)據(jù)驗證，結(jié)果類似，證明懸尾測試軟件能準確真實的反應(yīng)動物的懸尾行為。

表1 人工計時與懸尾測試軟件的相關(guān)系數(shù)

圖4 丙咪嗪、帕羅西汀對懸尾不動時間的影響(mean±SEM，**P < 0.01，與正常組比較)

圖5 丙咪嗪、帕羅西汀對小鼠懸尾狀態(tài)下“功”值的影響(mean±SEM，**P < 0.01，與正常組比較)

2.3.2 陽性藥對“不動時間”及“功”指標的驗證

由圖4可見，與對照組比較，丙咪嗪、帕羅西汀可顯著縮短懸尾不動時間(P< 0.01)。

圖5結(jié)果顯示，與對照組比較，帕羅西汀可顯著增加懸尾小鼠“功”值(P< 0.01)。

3 討論

本研究提供了一套具有自主知識產(chǎn)權(quán)的適用于小鼠的懸尾實驗實時檢測分析處理系統(tǒng)。該系統(tǒng)以傳感器為原理，具有高度靈敏性和穩(wěn)定性，并建立了反應(yīng)小鼠掙扎強度的“功”指標，填補了國內(nèi)以傳感器為原理的懸尾測試儀研發(fā)的空白。

目前，國內(nèi)外懸尾測試儀的原理有三種，包括傳感器、視頻原理及紅外熱釋電原理。視頻原理，經(jīng)常采用質(zhì)心跟蹤的方法，但對懸尾實驗并不合適。因為動物在懸吊過程中，會產(chǎn)生以逃避為導(dǎo)向的運動，但質(zhì)心變化可能并不明顯，質(zhì)心跟蹤的方法顯然不能有效識別動物的“動”和“不動”狀態(tài)。識別鼠足，是簡單、有效的跟蹤方法，但要求動物腹部必須始終對準攝像頭。另外，動物掛在懸尾箱內(nèi)，對背景光的強度和穩(wěn)定性有一定要求，并且需要避免反光。其次，一般情況下，攝像頭距離懸尾箱30 cm左右，跟蹤效果比較理想，但僅限于一個樣本的觀察。增加攝像頭和懸尾箱的距離，可以增加樣本數(shù)，即跟蹤兩個或兩個以上的動物。但隨著攝像頭和懸尾箱距離的加大，識別效果變差。廣角鏡頭也不能有效解決這一問題。由此可見，視頻跟蹤的原理，并不適于懸尾儀器的研發(fā)。Juszczak[7]曾于2006年發(fā)表懸尾視頻分析的文章，但此后，視頻跟蹤的原理在國外并未大規(guī)模應(yīng)用于懸尾儀器。紅外熱釋電原理則易受外界環(huán)境溫度和動物運動狀態(tài)的影響，外界環(huán)境溫度過低或動物運動遲緩時，經(jīng)常出現(xiàn)誤判現(xiàn)象，導(dǎo)致結(jié)果不準確。傳感器原理能夠檢測到極微小的張力變化(如動物呼吸、胃腸蠕動等引起的張力變化)，具有極高的靈敏性和穩(wěn)定性，不受動物狀態(tài)、背景光的限制，在空間允許的情況下，可用于多樣本檢測，非常適于動物懸尾運動狀態(tài)的跟蹤。因此，我們選擇了力傳感器原理研制本系統(tǒng)，并通過閾值設(shè)定等方式，取得了敏感、穩(wěn)定的指標。

懸尾實驗，主要用于抗抑郁藥物的篩選。因此，必須滿足多樣本要求。同時，實現(xiàn)多樣本同時懸掛也是亟待解決的問題。本系統(tǒng)通過橫梁的自動升降，解決了這一問題，節(jié)省了人力，并保證了實驗數(shù)據(jù)的客觀性。另外，建立自然光線下安靜、穩(wěn)定的實驗環(huán)境，是保證行為學(xué)實驗數(shù)據(jù)可靠性的先決條件。國內(nèi)外的懸尾儀器產(chǎn)品，懸尾箱的設(shè)計均為側(cè)面開放，動物易受周圍環(huán)境的干擾。本系統(tǒng)懸尾箱采用四周封閉，頂面開放的形式，既避免了周圍環(huán)境的干擾，同時，又可采集自然光線，保證了實驗數(shù)據(jù)的可靠性。除統(tǒng)計樣本的運動參數(shù)(運動時間和不動時間)外，本系統(tǒng)提出了“功”的概念，用于反應(yīng)動物的掙扎強度，從而更細致地反應(yīng)抗抑郁藥物的藥效。

保證懸尾實驗實時監(jiān)測分析處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)的準確性，是該儀器研發(fā)最為重要的環(huán)節(jié)之一。通過人機數(shù)據(jù)相關(guān)性分析對系統(tǒng)提供的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性驗證，是儀器研發(fā)最為基本和最為重要的工作[8]。通過SPSS相關(guān)性統(tǒng)計分析，我們發(fā)現(xiàn)，當運動閾值設(shè)為26.8時，人機相關(guān)系數(shù)達94%，雙側(cè)P=0.000，具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明懸尾測試軟件能準確真實的反應(yīng)動物的懸尾行為。

丙咪嗪為三環(huán)類抗抑郁藥物，經(jīng)常作為陽性藥應(yīng)用于抑郁癥相關(guān)的實驗研究[9]。帕羅西汀為5-羥色胺重攝取抑制劑，具有高效、強力的抗抑郁作用，可顯著縮短懸尾實驗動物不動時間[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，丙咪嗪和帕羅西汀的抗抑郁作用在懸尾實驗實時檢測分析處理系統(tǒng)中可得到良好體現(xiàn)，驗證了該系統(tǒng)的有效性。帕羅西汀還使小鼠“功”值增加，即增強懸尾小鼠的掙扎強度，顯示了其強有效的抗抑郁作用。丙咪嗪未表現(xiàn)出該作用。

綜上所述，基于傳感器原理，研制了懸尾實驗實時監(jiān)測分析處理系統(tǒng)，實現(xiàn)了懸尾實驗的自動化，客觀化，重復(fù)性好，人機數(shù)據(jù)高度相關(guān)，指標敏感，并增加了“功”和“功率”等反應(yīng)懸尾動物掙扎強度的指標，使抗抑郁藥物活性評價更加細致，可推廣應(yīng)用于抗抑郁藥物篩選和抑郁癥病理機制的研究。

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