馮建儒，范晨龍，丁 燏

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院//廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害防控廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）隸屬于弧菌科（Vibrionaceae）弧菌屬（Vibrio），為嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧的革蘭陰性菌[1-2]，廣泛分布于海洋環(huán)境和海洋生物中，可感染魚、蝦、貝等海水養(yǎng)殖動(dòng)物[3-5]。近年來，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，由溶藻弧菌引起的暴發(fā)性弧菌病呈不斷上升趨勢[6-7]，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。

在生物系統(tǒng)中，干旱、低溫、高溫、鹽脅迫、抗生素、重金屬和紫外輻射等各種環(huán)境脅迫可誘發(fā)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生，對細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷。生物細(xì)胞內(nèi)的重要氧化劑谷胱甘肽（GSH），可有效抵抗ROS 對細(xì)胞的傷害，維持細(xì)胞內(nèi)較穩(wěn)定的氧化還原平衡狀態(tài)[9-10]。谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）是谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)中主要抗氧化酶之一，廣泛分布于原核生物和真核生物中[11]。在還原型輔酶NADPH 作用下，GR 催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）轉(zhuǎn)化為還原型谷胱甘肽，為有效清除細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ROS 提供還原力，從而保護(hù)細(xì)胞免受傷害，是在氧化應(yīng)激期間維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的關(guān)鍵酶[12-13]。因此，GR 在氧化應(yīng)激[14-15]、冷應(yīng)激[16]、鹽脅迫[17]和金屬離子耐受性[12]等應(yīng)激反應(yīng)中有重要作用。呂潔婷等[18]研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）gr 基因缺失后，其運(yùn)動(dòng)能力、感染宿主能力及抗氧化應(yīng)激等增強(qiáng)。龐歡瑛等[19]將與GR 同屬于黃素蛋白氧化還原酶家族的二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLDH）的dldh 基因敲除后，溶藻弧菌的泳動(dòng)能力、生物膜形成能力、生長和胞外蛋白酶活性等均減弱。有關(guān)溶藻弧菌gr 基因缺失株的生物學(xué)特性未見報(bào)道。本研究通過同源重組技術(shù)和Overlap PCR 等分子生物學(xué)手段構(gòu)建溶藻弧菌gr 基因缺失株，比較其與野生株HY9901 的生物學(xué)差異，為防治溶藻弧菌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 溶藻弧菌HY9901（V.alginolyticus）、大腸桿菌DH5α（Escherichia coli DH5α）、大腸桿菌β2163（E.coli β2163）均保存于廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（下稱“本實(shí)驗(yàn)室”）。

1.1.2質(zhì)粒 自殺質(zhì)粒pLP12（含氯霉素Cm）取自本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3主要試劑和引物 LB 液體培養(yǎng)基，酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L 及NaCl 30 g/L；LB 固體培養(yǎng)基，酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 30 g/L 及瓊脂粉15 g/L；氯霉素（Cm），生工生物工程（上海）股份有限公司；切膠回收純化和質(zhì)粒提取試劑盒，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；細(xì)菌總DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；pMD-18T 克隆載體，Takara 公司；藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司；PrimerSTAR Max，Takara 公司；引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 溶藻弧菌gr 基因的缺失株構(gòu)建的引物Table 1 Construction of primers for deletion of gr gene of V.alginolyticus

1.2 方法

1.2.1缺失株△gr 的構(gòu)建 以gr-MF1/gr-MR1 擴(kuò)增得 GR 上游同源臂 A 片段 612bp；以gr-MF2/gr-MR2 擴(kuò)增得GR 下游同源臂B 片段577 bp，純化A、B 片段，經(jīng)Overlap PCR 擴(kuò)增后，獲得1 189 bp 融合AB 片段。將純化的AB 片段與自殺質(zhì)粒pLP12（Cm+）連接，得重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB 平板（含Cm 20 μg/mL，D-葡萄糖3 g/L）。用pLP-UF/pLP-UR 篩選AB 插入的重組克隆，陽性克隆經(jīng)純化、擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒pLP12(Cm+)-gr，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌β2163，培養(yǎng)3 h，涂布于LB 平板（含Cm 20 μg/mL，二氨基庚二酸 (Diaminopimelic acid,DAP) 0.3 mmol/L，D-葡萄糖3 g/L），挑取陽性克隆，劃線純化培養(yǎng)。分別將大腸桿菌β2163[pLP12（Cm+）-gr] 與溶藻弧菌培養(yǎng)24 h，分別取400 μL 供體菌和800 μL 受體菌，混勻，離心，去上清，以LB 培養(yǎng)基重懸，重復(fù)1 次，滴入LB平板 (含DAP 0.3 mmol/L，D-葡萄糖3 g/L)，于37 ℃下倒置培養(yǎng)6 h。以1 mL LB 重懸，稀釋后取100 μL 涂布于LB 平板（含Cm 20 μg/mL，D-葡萄糖 3 g/L），挑取單克隆，液體培養(yǎng)，以gr-TF/PLP-UTR 對克隆進(jìn)行檢測。挑取陽性克隆，稀釋，涂布于LB 平板（含L-阿拉伯糖4 g/L），于30 ℃下培養(yǎng)24 h，挑取平板上的克隆，以引物gr-TF/gr-TR 進(jìn)行檢測，并遞交PCR 產(chǎn)物測序驗(yàn)證，獲得△gr 缺失株，穩(wěn)定遺傳 30 代后，置于-80 ℃下保存。以上實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)表1 設(shè)計(jì)的對應(yīng)引物進(jìn)行菌落PCR 鑒定并測序，反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL，PrimerSTAR Max 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，X ℃ 20 s，72 ℃ Y s，72 ℃ 7 min，30 個(gè)循環(huán)。

1.2.2缺失株△gr 的驗(yàn)證 采用RNA 試劑盒分別提取溶藻弧菌HY9901 野生株和缺失株△gr 的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 作為模板，利用一對特異性引物（gr-F/gr-R）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，選取野生株HY9901 作為陽性對照，用10 mg/mL 凝膠電泳檢測。

1.2.3缺失株△gr 遺傳穩(wěn)定性的測定 溶藻弧菌缺失株△gr 菌液和新鮮TSB 培養(yǎng)基按體積比1∶100的比例連續(xù)傳30 代后，用引物gr-TF/gr-TR 對片段進(jìn)行擴(kuò)增，檢測缺失株△gr 的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.4生長曲線繪制 分別將溶藻弧菌野生株HY9901 和缺失株△gr 接種于新鮮TSB 中，培養(yǎng)8 h以上，將光密度D(600 nm) 調(diào)至約0.5，以1∶100稀釋培養(yǎng)，每2 h 測定波長600 nm 下的光密度值，繪制兩株菌的生長曲線。重復(fù)3 次。

1.2.5抗生素藥敏實(shí)驗(yàn) 將200 μL、D(600 nm) 值約為0.5 的菌液涂布于TSB 營養(yǎng)瓊脂平板上，放置干燥，以無菌操作將藥敏紙片放置于TSB 平板，輕輕按壓，貼標(biāo)簽，置于恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后觀察。

1.2.6生物膜的測定 分別用適量新鮮TSB 洗脫在TSA 平板上培養(yǎng)的野生株和缺失株，將菌液D(600 nm) 調(diào)至0.5，再分別用新鮮的TSB 稀釋20倍，轉(zhuǎn)至96 孔板中，28 ℃下靜置24 h；用無菌ddH2O 洗滌3 次，倒置晾干；用甲醇固定20 min，室溫晾干，倒置30 min，在室溫下加入結(jié)晶紫染液染色15 min，用自來水沖洗至澄清后自然晾干；最后加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，自然放置30 min，用酶標(biāo)儀測定波長570 nm 下的光密度值。重復(fù)3 次。

1.2.7細(xì)菌泳動(dòng)實(shí)驗(yàn) 分別挑取野生株和缺失株的單菌落，穿刺接種于3 g/L 的瓊脂TSA 平板中，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 以上，測量兩菌株的泳動(dòng)圈直徑。重復(fù)3 次。

1.2.8胞外蛋白酶活性的測定 分別將培養(yǎng)12 h以上的野生株和缺失株涂布于鋪有玻璃紙的TSA平板上，放置于28 ℃下培養(yǎng)18 h，加入適量磷酸鹽緩沖液（PBS）洗脫，以4 ℃、8 000 g 條件離心30 min，收集上清，用孔徑0.22 μm 濾膜過濾，所得野生株和缺失株的胞外蛋白酶產(chǎn)物保存于4 ℃。分別取100 μL 野生株和缺失株的胞外蛋白酶與100 μL 偶氮酪蛋白溶液混合均勻，用Tris-HCl 緩沖液稀釋至500 μL，置于37 ℃下孵育30 min。加入適量的100 g/L 三氯乙酸終止反應(yīng)，以10 000 g 離心10 min，收集上清，加入NaOH 溶液顯色，測定在波長442 nm 下的光密度值，以煮沸的滅活樣品作為空白對照組。重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 缺失株△gr 的構(gòu)建

以引物gr-TF/gr-TR 進(jìn)行檢測，以野生型為對照，突變型經(jīng)擴(kuò)增得到1 343 bp 片段，野生型擴(kuò)增片段長2 648 bp（圖1）。經(jīng)測序，結(jié)果證實(shí)溶藻弧菌gr 缺失株構(gòu)建成功。

圖1 溶藻弧菌gr 缺失突變檢測Fig.1 Detection of gr mutant

2.2 缺失株△gr 的驗(yàn)證

圖2(A)表明，已構(gòu)建的缺失株△gr 經(jīng)cDNA 驗(yàn)證，提取得到的RNA 完整。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果表明野生株HY9901 在1 400 bp 處左右有特異性條帶，其他的不存在條帶 [圖2(B)]，證明已成功構(gòu)建了溶藻弧菌HY9901 的缺失株△gr。

圖2 缺失株△gr 的驗(yàn)證Fig.2 Verification of mutant strain △gr

2.3 缺失株△gr 遺傳穩(wěn)定性

圖3 表明，缺失株△gr 經(jīng)連續(xù)傳30 代后，仍可準(zhǔn)確擴(kuò)增出gr 基因上下游融合片段，表明所構(gòu)建缺失株△gr 的遺傳信息可在子代中穩(wěn)定地傳遞。

圖3 溶藻弧菌缺失株△gr 穩(wěn)定性檢驗(yàn)Fig.3 Hereditary stability of mutant strain △gr

2.4 生長曲線

在 TSB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的溶藻弧菌野生株HY9901 和缺失株△gr 所得到的生長曲線見圖4。圖4 可見，缺失株△gr 生長情況與HY9901 一致，即敲除gr 基因?qū)θ茉寤【L無明顯影響。

圖4 溶藻弧菌野生株HY9901 和缺失株△gr 的生長曲線Fig.4 Growth curve of strain HY9901and △gr

2.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

溶藻弧菌缺失株△gr 對四環(huán)素、克林霉素和呋喃唑酮等藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。表2 可見，缺失株△gr 對四環(huán)素、克林霉素和呋喃唑酮等耐藥性減弱。

表2 藥敏實(shí)驗(yàn)抑菌圈直徑Table 2 Diameters of bacterial inhibition zone in drug sensitive tests

2.6 生物膜

圖5 可見，培養(yǎng)24 h 的野生株和缺失株的生物膜形成能力差異顯著（P＜0.05），與野生株相比，缺失株△gr 的生物膜顯著增厚。

圖5 溶藻弧菌野生株HY9901和缺失株△gr生物膜形成能力Fig.5 Biofilm formation of strain HY9901and △gr

2.7 泳動(dòng)能力

培養(yǎng)12 h 后野生株和缺失株的泳動(dòng)能力如圖6所示。結(jié)果表明gr 基因的缺失顯著減弱了溶藻弧菌的泳動(dòng)能力（P＜0.01）。

圖6 溶藻弧菌野生株HY9901 和缺失株△gr 的泳動(dòng)能力Fig.6 The swarming motility of strain HY9901 and △gr

2.8 胞外蛋白酶活性

胞外蛋白酶作為細(xì)菌釋放于環(huán)境中的代謝物，包含有酪蛋白酶、溶血素、明膠酶、淀粉酶和鐵載體等多種活性物質(zhì)，是致病菌的主要毒力因子之一。與野生株相比，缺失株△gr 的胞外蛋白酶活性顯著降低（P＜0.01）（圖7）。

圖7 溶藻弧菌野生株HY9901和缺失株△gr胞外蛋白酶活性Fig.7 ECPase activity of strain HY9901 and △gr

3 討論

在生物體氧化還原代謝的過程中，GR 為一種極其重要的抗氧化酶，對清除細(xì)胞內(nèi)ROS，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)有重要作用[20]。學(xué)界正不斷深入研究GR 在生物體發(fā)育、疾病防御、抗非生物脅迫及氧化應(yīng)激等方面的作用。

為更好了解gr 基因在溶藻弧菌抗氧化中的作用，本研究敲除溶藻弧菌gr 基因，缺失株△gr 遺傳信息可在子代中穩(wěn)定地傳遞。與野生株相比，缺失株△gr 的生長趨勢變化不大，這可能是因?yàn)間r 基因的缺失對其攝取與消化營養(yǎng)物質(zhì)幾無影響，也可能因?yàn)槎晔墉h(huán)境脅迫較少。

抗生素可抑制細(xì)菌生長繁殖或殺死細(xì)菌，多由細(xì)菌自身合成的化學(xué)物質(zhì)，可殺死周圍環(huán)境的其他微生物來維持細(xì)菌體內(nèi)平衡[21]，通過阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁合成、增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性、抑制蛋白質(zhì)合成、阻礙細(xì)菌DNA 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮抗菌作用。目前，使用抗生素仍是控制弧菌病的主要手段，但濫用抗生素會(huì)導(dǎo)致耐藥菌的出現(xiàn)[22-26]。研究表明，抗生素刺激細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧和自由基，破壞細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，引起細(xì)胞的損傷[27-28]。因此，本研究中，溶藻弧菌在敲除gr 基因后，其對四環(huán)素、克林霉素和呋喃唑酮等敏感性提高，可能由缺失株的清除活性氧能力減弱所致。

生物膜的形成是微生物之間通過協(xié)同作用形成的一種生存策略[29]，也是微生物適應(yīng)復(fù)雜多變的生存環(huán)境和抵御不良環(huán)境因素的重要手段[30-32]。研究表明，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的生物膜形成與活性氧（ROS）的增加相關(guān)[33]。本研究中，缺失株△gr 的生物膜出現(xiàn)增厚現(xiàn)象，推測溶藻弧菌在敲除gr 基因后，細(xì)菌內(nèi)的氧化應(yīng)激水平提高，使生物膜形成得以進(jìn)一步增強(qiáng)，從而抵御不良的環(huán)境因素。

鞭毛是細(xì)菌表面重要的附屬結(jié)構(gòu)，對其泳動(dòng)能力有直接影響[34-35]。本研究中，與野生株相比，缺失株△gr 的泳動(dòng)能力顯著減弱，推測gr 基因的缺失可能對鞭毛的產(chǎn)生或運(yùn)動(dòng)造成一定的影響，進(jìn)而減弱缺失株的泳動(dòng)能力，但泳動(dòng)能力變化機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

細(xì)菌的毒力因子與其致病性有緊密的關(guān)系，胞外蛋白酶是細(xì)菌主要的毒力因子，不僅通過消化為細(xì)菌的生長供應(yīng)必要的營養(yǎng)物質(zhì)，還可直接對宿主的免疫防御系統(tǒng)造成破壞[36]。本研究中，gr 基因的缺失使溶藻弧菌的胞外蛋白酶活性顯著降低，缺失株△gr 毒力可能減弱，推測gr 基因可能在其胞外蛋白酶的分泌或活性等方面有一定作用。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建gr 基因缺失株△gr。與溶藻弧菌野生株HY9901 比較，該缺失株對四環(huán)素、克林霉素和呋喃唑酮等耐藥性減弱，生物膜形成能力顯著增強(qiáng)，胞外蛋白酶活性顯著降低，泳動(dòng)能力顯著減弱。因此，GR 在溶藻弧菌的毒力、生物膜形成、藥物敏感性、泳動(dòng)等方面有重要作用。