潘曉鴻,洪纖纖,方 云,饒文華,陳芳容,聶丹玥,郭雪萍,張頂洋,關 雄

(福建農(nóng)林大學閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室/生物農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室，福建 福州 350002)

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種廣泛分布于自然環(huán)境中的革蘭氏陽性桿狀細菌，具有形成快、營養(yǎng)簡單的特點.其菌制劑由于容易生產(chǎn)、保存時間較長且田間使用方便，已成為應用最為廣泛的生物農(nóng)藥之一[1]，主要用于防治大多數(shù)絲狀真菌引起的田間病害，如棉花枯萎病、荔枝霜疫病等[2].生物膜是指細菌通過分泌多糖、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)以連結細菌群體而形成的具有黏附性有組織的膜狀結構[3-6].生物膜能將細胞與細胞緊密連結起來，提高彼此之間的基因轉(zhuǎn)移與交換頻率，從而增強其環(huán)境適應能力，增加種群多樣性[7]，最終使其發(fā)揮正常的生防和促生作用.枯草芽孢桿菌在農(nóng)田中通常以生物膜形式定殖于植物根系[8]，這種特征可以保護植物根系免受其他病原物侵害，使根系上的細胞群體數(shù)量保持在較高水平，從而分泌較高濃度的抗生素和胞外酶；同時有利于細菌自身抵御外界不良環(huán)境，保持其生防能力.枯草芽孢桿菌生物膜形成能力越強，防治植物病害效果越顯著[1].因此，研究生物膜的形成能力及形成條件將有助于今后生防細菌的遺傳改良研究及合理使用.

當前學者們主要針對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[9]、大腸桿菌(Escherichiacoli)[10]、單增李斯特菌(Listeriamonocytogene)[11]的生物膜進行了研究，而有關產(chǎn)孢菌類生物膜的研究較少，枯草芽孢桿菌生物膜形成條件的優(yōu)化研究則更少.李南薇等[12]利用平板菌落計數(shù)法針對蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)生物膜培養(yǎng)溫度、pH值、培養(yǎng)基濃度、碳源、無機鹽5個因素進行了優(yōu)化；吳園園等[13]采用比濁法對枯草芽孢桿菌NCD-2生物膜培養(yǎng)基種類、溫度、金屬離子進行了優(yōu)化；馬悅等[14]結合上述兩種方法探究了蠟樣芽孢桿菌生物膜的形成條件.本研究以結晶紫染色法和烘干稱重法相結合對枯草芽孢桿菌液體生物膜形成能力進行評估，同時對其培養(yǎng)基成分[葡萄糖、鎂離子(Mg2+)、鈣離子(Ca2+)濃度]和培養(yǎng)環(huán)境(pH值、溫度)進行篩選，并通過L16(45)正交試驗進行優(yōu)化，為進一步合理利用枯草芽孢桿菌生物膜和研究該菌的生防機理奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌菌株BS-2，由福建農(nóng)林大學生物農(nóng)藥與化學生物學教育部重點實驗室保存.液體LB培養(yǎng)基：1%氯化鈉，1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，調(diào)節(jié)pH值為7.2，高壓滅菌.固定LB培養(yǎng)基：稱取2.5 g瓊脂粉緩慢倒入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，高壓滅菌.

1.1.2 試劑 Mg2+、Ca2+母液：稱量適量的氯化鎂、氯化鈣，在水溶液中配制成濃度分別為 0.01、0.1、1、10、20、30 mmol·L-1的母液，高壓滅菌.

葡萄糖母液：稱取適量的葡萄糖，在水溶液中配制濃度為2、4、6、8、10、12 g·L-1的葡萄糖溶液，用超濾膜過濾.

1.2 生物膜形成能力的評估方法

1.2.1 菌液的制備 將-80 ℃保藏的BS-2菌株按1%接種到1.5 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r·min-1隔夜培養(yǎng)后，將該菌液均勻地涂于平板活化，一段時間后挑取單菌落于試管LB中.待試管內(nèi)溶液變渾濁，將菌液再次轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，進行擴大培養(yǎng)，使菌液D600 nm≈2.8(約10 h)[15]，用于后續(xù)試驗.

1.2.2 96孔板染色法 按1%轉(zhuǎn)接量將菌液接種到具有不同培養(yǎng)條件的LB液體培養(yǎng)基中，逐一分裝入96孔板，每孔為180 μL，重復3次.培養(yǎng)結束后慢慢拿出平板，在每孔內(nèi)加入200 μL 0.1%結晶紫染色液進行染色，將菌液充分甩干后輕柔地沖洗3次，再加入200 μL 95%乙醇，靜置若干分鐘后混勻[13].使用酶標儀測定其D595 nm值，以此判斷生物膜的形成能力.

1.2.3 觀察法 按1%轉(zhuǎn)接量將菌液接種到裝有新鮮LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，每個處理設置3個重復.靜置培養(yǎng)1 d后，觀察錐形瓶內(nèi)生物膜形成厚度，拍照記錄.

1.2.4 烘干稱重法 標記并稱量錐形瓶凈重，在不同試驗條件下培養(yǎng)生物膜后，使用移液槍除去培養(yǎng)基，保留生物膜，并放入64 ℃干燥烘箱中烘干24 h，稱量含有生物膜干物質(zhì)的錐形瓶質(zhì)量并計算前后之差，每個處理設置3個重復.根據(jù)生物膜烘干質(zhì)量絕對值大小，確定最佳的培養(yǎng)條件.

1.3 影響生物膜形成的單因素試驗

將培養(yǎng)溫度分別調(diào)節(jié)為25、30、35、40、45 ℃，比較溫度對生物膜形成的影響.用pH計調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基初始pH值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，比較pH值對生物膜形成的影響.將培養(yǎng)基中Mg2+和Ca2+濃度分別調(diào)節(jié)為0.01、0.1、1、10、20 mmol·L-1，比較Mg2+和Ca2+濃度對生物膜形成的影響[13].在LB液體培養(yǎng)基中分別加入除菌過濾后的葡萄糖溶液，使其濃度為2、4、6、8、10、12 g·L-1，比較葡萄糖濃度對生物膜形成的影響.

1.4 正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗的結果，設計葡萄糖濃度(A)、Mg2+濃度(B)、Ca2+濃度(C)、初始pH值(D)、溫度(E)5個影響因素的L16(45)正交試驗(表1)，同時以純LB培養(yǎng)基作為空白對照.按照1%轉(zhuǎn)接量接種菌液，記錄LB培養(yǎng)基中生物膜的干重.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2010進行統(tǒng)計，使用SPSS 18.0軟件進行方差分析和差異顯著性分析，使用Origin 8.0軟件作圖.

表1 影響枯草芽孢桿菌生物膜形成的5個因素的水平設計Table 1 Levels of 5 factors affecting the formation of B.subtilis biofilm

2 結果與分析

2.1 生物膜形成能力的評估方法

從圖1A可以看出，生物膜成熟后細胞聚集在一起且被胞外大分子團團包圍在內(nèi)部.當用結晶紫染色后，染色劑無法進入生物膜內(nèi)部，造成染色不充分(圖1B).試驗過程中觀察發(fā)現(xiàn)，新形成的尤其是氣液界面的生物膜較為疏松，若漂洗太過用力將造成生物膜破壞、脫落、丟失，若漂洗不徹底又不容易洗去雜質(zhì)，進而影響試驗結果.因此，進一步采用烘干稱重法定量評估生物膜形成能力.由圖1C-E可見，去掉培養(yǎng)基后生物膜仍保留完整，說明生物膜烘干稱重法可行.

A.生物膜于96孔板中培養(yǎng);B.生物膜被結晶紫染色;C.氣液界面的生物膜;D.生物膜烘干前;E.生物膜烘干后.圖1 枯草芽孢桿菌生物膜形態(tài)Fig.1 The morphology of B.subtilis biofilm

2.2 影響生物膜形成的單因素試驗結果

將菌液按1%轉(zhuǎn)接量接種至高壓滅菌的LB培養(yǎng)基中，探究不同溫度下枯草芽孢桿菌生物膜的形成量.結果表明：過低(<30 ℃)或過高(>40 ℃)溫度都不利于生物膜形成；35 ℃為生物膜形成的最適溫度，該溫度下生物膜的干重接近于45 ℃時的2倍(圖2A).

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值，經(jīng)過高壓滅菌后接種菌液，并放入35 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1 d.結果表明，枯草芽孢桿菌生物膜形成能力隨著pH值升高而降低，初始pH=5.0時，生物膜干重最大(圖2B).

將培養(yǎng)基初始pH值調(diào)節(jié)為5.0，高壓滅菌后接種菌液，并分別向培養(yǎng)基中添加0.01、0.1、1、10、20、30 mmol·L-1Mg2+溶液，35 ℃下靜置培養(yǎng)1 d.結果表明，Mg2+濃度在1～20 mmol·L-1時，對枯草芽孢桿菌生物膜起促進作用，濃度高于20 mmol·L-1時會抑制生物膜形成.當Mg2+濃度為20 mmol·L-1時，生物膜干重最大(圖2C).

將培養(yǎng)基初始pH值調(diào)節(jié)為5.0，高壓滅菌后接種菌液，并添加經(jīng)過滅菌的20 mmol·L-1Mg2+溶液，再分別添加0.01、0.1、1、10、20、30 mmol·L-1Ca2+溶液，35 ℃下靜置培養(yǎng)1 d.結果表明，Ca2+能促進生物膜合成，最優(yōu)Ca2+濃度為20 mmol·L-1(圖2D).

將培養(yǎng)基初始pH值調(diào)節(jié)為5.0，高壓滅菌后接種菌液，并分別向培養(yǎng)基中添加20 mmol·L-1Mg2+溶液和20 mmol·L-1Ca2+溶液，同時分別添加2、4、6、8、10、12 g·L-1過濾除菌的葡萄糖溶液，35 ℃下靜置培養(yǎng)1 d.結果表明：LB培養(yǎng)基添加葡萄糖后，生物膜形成能力逐步上升，當葡萄糖濃度為6 g·L-1時生物膜干重最大；當葡萄糖濃度進一步提高時，生物膜的形成能力逐漸下降，最后趨于平穩(wěn)(圖2E).

圖2 培養(yǎng)溫度(A)、pH值(B)、Mg2+濃度(C)、Ca2+濃度(D)和葡萄糖濃度(E)對生物膜形成的影響Fig.2 Effects of culture temperature (A),pH (B),Mg2+ concentration (C),Ca2+ concentration (D) and glucose concentration (E) on biofilm formation

2.3 正交試驗結果

從表2的R值可得，各因素對枯草芽孢桿菌生物膜形成的影響大小依次為初始pH值(D)>葡萄糖濃度(A)>Mg2+濃度(C)>Ca2+濃度(B)>溫度(E).由表3也可得，初始pH值對生物膜形成的影響程度最大(P<0.05).從k值可以看出，A因素表現(xiàn)為A4>A3>A2>A1，B因素表現(xiàn)為B3>B1>B2>B4，C因素表現(xiàn)為C2>C1>C3>C4，D因素表現(xiàn)為D4>D3>D2>D1，E因素表現(xiàn)為E1>E2>E3>E4.因此，最優(yōu)組合為A4B3C2D4E1(15號組合)，即葡萄糖濃度為12 g·L-1，Mg2+濃度為10 mmol·L-1，Ca2+濃度為1 mmol·L-1，培養(yǎng)基初始pH值為8.0，培養(yǎng)溫度為25 ℃.此外，通過肉眼觀察生物膜在氣液界面的形態(tài)(圖3)也可以發(fā)現(xiàn)，15號組合中生物膜最為致密、成熟.

表2 枯草芽孢桿菌生物膜形成優(yōu)化的正交試驗設計方案與結果1)Table 2 Design and results of orthogonal experiment for the optimization of B.subtilis biofilm formation

表3 正交試驗結果方差分析1)Table 3 ANOVA analysis of orthogonal experiment results

3 討論與結論

當前，研究生物膜常用的方法有試管法、定量檢測微孔板法、置片法等，這些方法能在一定程度上模擬生物膜的形成過程，但生物膜生長牢度不足，對生物膜形成的判斷偏主觀性，因而評估結果差異大，不夠準確[16]，并且相同的細菌在不同培養(yǎng)方法中形成生物膜的能力差異較顯著[17].結晶紫法是觀察生物膜形成的常用方法，它可以快速直接地觀察到生物膜，但同時會出現(xiàn)染色不夠充分，在漂洗過程中生物膜容易脫落、丟失，不能完整保存等缺點.平板菌落計數(shù)法也被用于生物膜的檢測中，但由于大部分的微生物不可培養(yǎng)，可能造成檢測出的生物量遠小于實際的生物量.烘干稱重法可以較為準確地評價生物膜的形成，但其存在有效性較差的缺點.因此，需要結合多種方法開展生物膜的研究.

枯草芽孢桿菌生物膜的形成與其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、多糖等胞外基質(zhì)濃度有關[18].據(jù)報道，葡萄糖相較于其他碳源對生物膜活性影響最顯著[19].本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖在低濃度(2～6 g·L-1)時對生物膜形成表現(xiàn)為促進作用，但過多葡萄糖則起抑制作用.金屬離子Mg2+和Ca2+可影響細菌芽孢的形成[15]，而枯草芽孢桿菌生物膜形成與其芽孢產(chǎn)生有關[20]，因此Mg2+和Ca2+濃度能間接影響生物膜形成.據(jù)報道，適當濃度Ca2+可加快許多微生物形成速度[21-22].本試驗結果表明，低濃度(0.01～20 mmol·L-1)Ca2+對枯草芽孢桿菌生物膜形成表現(xiàn)為促進作用，濃度大于20 mmol·L-1則表現(xiàn)為輕微抑制作用.與此類似，低濃度(1～20 mmol·L-1)Mg2+能夠提高生物膜形成能力，但當其濃度大于20 mmol·L-1則會減弱生物膜形成能力.除了培養(yǎng)基成分會影響生物膜形成外，培養(yǎng)環(huán)境對其也有不同程度的影響.其中，pH值對生物膜形成的影響尤為顯著，弱酸性與中性環(huán)境中細菌形成最旺[23]；過高或者過低的溫度都不利于生物膜形成.

1～16的試驗方案見表2.圖3 16個正交組合所得生物膜比較Fig.3 Comparison on biofilms in 16 orthogonal combinations

本研究在單因素試驗基礎上進行正交試驗設計，結果發(fā)現(xiàn)：當培養(yǎng)基中含12 g·L-1葡萄糖、10 mmol·L-1Mg2+、1 mmol·L-1Ca2+，且初始pH值為8.0，在25 ℃下培養(yǎng)時，生物膜的形成能力最強，此時生物膜干重為0.167 9 g，與空白對照相比，生物膜干重提高了40%.