張琪，朱磊，黃鈺淇，陳永鋒

1.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091；2.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 湛江 524023

銀屑病是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、紅斑鱗屑性皮膚病，其發(fā)病率在全球范圍約為2%，在高加索人和斯堪的納維亞人中發(fā)病率更高，達(dá)11%左右［1］，發(fā)病機(jī)制主要包含環(huán)境因素、感染因素、自身免疫因素以及遺傳易感因素等。在對銀屑病發(fā)病機(jī)制的探究中，目前發(fā)現(xiàn)IL-23/IL-17炎癥軸起著重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)TNF、IL-17、IL-22等可進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-36產(chǎn)生［2-3］，諸多研究發(fā)現(xiàn)IL-36與銀屑病發(fā)病關(guān)系密切。銀屑病目前常用藥物主要有阿維A、甲氨蝶呤、環(huán)孢素、外用維生素D3衍生物、糖皮質(zhì)激素及生物制劑等［4］，通過不同組合，銀屑病的治療方案多種多樣，但是大多情況下銀屑病患者經(jīng)過系統(tǒng)治療后，相關(guān)癥狀也只是部分緩解，甚至部分患者治療療效欠佳，長期外用糖皮質(zhì)激素帶來的副作用也顯而易見。最近幾年，中醫(yī)藥在銀屑病治療方面突顯出了一些獨(dú)特優(yōu)勢，在臨床中應(yīng)用范圍也較廣，對患者癥狀改善及疾病預(yù)后具有推動(dòng)作用［5］。養(yǎng)血解毒湯為北京中醫(yī)藥大學(xué)趙炳南老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方［6］，在血燥型銀屑病中應(yīng)用廣泛，目前對于銀屑病的中藥治療，大多是由該經(jīng)驗(yàn)方加減而成，對于銀屑病的有效率較高［7］，然而其具體作用機(jī)制仍不明了。本課題旨在初步探究養(yǎng)血解毒湯對于小鼠銀屑病樣皮損的影響及其作用機(jī)制，為養(yǎng)血解毒湯治療銀屑病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源

本實(shí)驗(yàn)所用C57小鼠均購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑與儀器

養(yǎng)血解毒湯(南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院)、5%咪喹莫特乳膏(美國3M)、醫(yī)用凡士林(天津致遠(yuǎn))、IL-36β/IL-1F8單克隆抗體(美國RD)、上下游引物(上海生工)、DEPC水(上海生工)、ECL發(fā)光液(上海生工)、Trizol? reagent(日本TaKa-Ra)、PrimeScript RT reagent kit with gDNA Erase(日本TaKaRa)、SYBR? Premix EX Taq TMⅡ(日本TaKaRa)。Leica2135石蠟病理切片機(jī)(德國Leica公司)、NanoDrop核酸濃度測量儀(美國賽默飛)、熒光定量PCR儀(美國Bio-rad)。

1.3 方法

1.3.1 建立模型將18只SPF級(jí)雌性、6～8周齡的C57小鼠隨機(jī)分為對照組(凡士林+生理鹽水)、模型組(5%咪喹莫特+生理鹽水)、實(shí)驗(yàn)組(5%咪喹莫特+養(yǎng)血解毒湯)，每組6只，于小鼠背部剃去約2 cm×3 cm區(qū)域的毛發(fā)。每天早上在小鼠剃毛區(qū)涂抹62.5 mg 5%咪喹莫特或凡士林，下午在小鼠剃毛區(qū)涂抹1 mL養(yǎng)血解毒湯或生理鹽水。每天觀察和記錄小鼠皮損變化，在用藥第8天進(jìn)行最終評(píng)分，用脊椎脫臼法處死小鼠，取背部約1 cm×1 cm大小的皮損并用10%福爾馬林固定，剩余皮損放-80℃冰箱保存。

1.3.2 評(píng)價(jià)小鼠銀屑病皮損根據(jù)小鼠剃毛區(qū)紅斑、鱗屑及斑塊肥厚程度對皮損進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［8］如下：①紅斑：無明顯紅斑為0分；淡紅色為1分；紅色為2分；深紅色為3分；極深紅色為4分。②鱗屑：無明顯可見鱗屑為0分；細(xì)微鱗屑為1分；片狀鱗屑為2分；堆積成層的鱗屑為3分；堆積成層且十分厚密的鱗屑為4分。③斑塊：肥厚程度平齊于正常皮膚為0分；輕微高出于正常皮膚表面為1分；中度隆起為2分；隆起明顯、肥厚為3分；隆起極為明顯為4分。三個(gè)指標(biāo)評(píng)分之和為皮損嚴(yán)重程度評(píng)分。

1.3.3 HE染色與免疫組化染色對小鼠皮損進(jìn)行固定、洗滌與脫水、包埋、切片、脫蠟、HE染色、免疫組化染色、封片，顯微鏡下觀察各組小鼠背部皮損組織學(xué)形態(tài)及IL-36β水平，拍照保存。

1.3.4 RT-qPCR檢測皮損中IL-36α、IL-36β、IL-36γ及IL-36Ra mRNA水平取50 mg小鼠皮損進(jìn)行研磨，利用TRIZOL法提取總mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)說明書步驟，分別加入所需試劑及上下游引物(表1)進(jìn)行qPCR，總反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 各組引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.5 Western blot檢測IL-36的蛋白表達(dá)研磨小鼠皮損，提取蛋白，配平及煮沸變性后，加入12%分離膠/5%濃縮膠中，電泳使蛋白分離(工作條件：60 V 30 min，120 V 60 min)，轉(zhuǎn)膜(工作條件：100 V 80 min)，隨后進(jìn)行封閉，孵育一抗(按1∶1 000濃度稀釋，4℃過夜)，隔天洗膜后室溫孵育二抗，洗滌后在發(fā)光成像儀中使用ECL液進(jìn)行顯影并拍照。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用GraphPad Prism5.0軟件分析數(shù)據(jù)與作圖，兩組間PASI評(píng)分及IL-36β mRNA表達(dá)水平等比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)血解毒湯對小鼠銀屑病皮損的影響

對照組小鼠背部皮損無明顯改變。模型組小鼠背部皮損自涂藥第2天起開始出現(xiàn)紅斑，并逐漸出現(xiàn)鱗屑、肥厚，在用藥7 d后皮損最明顯。實(shí)驗(yàn)組小鼠背部皮損自涂藥第2天起出現(xiàn)紅斑，并逐漸出現(xiàn)鱗屑、肥厚，在第4天皮損最明顯，隨時(shí)間推移，小鼠背部皮損逐漸減輕，用藥7 d后實(shí)驗(yàn)組小鼠背部皮損明顯輕于模型組(圖1)。對小鼠皮損嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分(圖2)，模型組與實(shí)驗(yàn)組小鼠用藥7 d后的PASI評(píng)分分別為7.83±0.69、1.17±0.37，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.07，P＜0.05)。

圖1 用藥7 d后小鼠背部皮損外觀 Figure 1 The appearance of skin lesions after 7 days of treatment．

圖2 小鼠PASI評(píng)分變化Figure 2 PASI score．

2.2 小鼠皮損的病理變化

對用藥7 d后各組小鼠背部皮損進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示，對照組小鼠皮膚組織病理無明顯改變；模型組小鼠出現(xiàn)銀屑病樣病理改變，如角質(zhì)層增厚、角化不全、可見Munro微膿腫、棘層增厚、顆粒層減少或消失等；實(shí)驗(yàn)組小鼠皮損無明顯銀屑病樣改變，僅出現(xiàn)表皮增厚，且厚度明顯薄于模型組(圖3)。

圖3 用藥7 d后小鼠背部皮損病理(HE，200×)Figure 3 HE staining of skin lesions after 7 days of treatment(200×)．

2.3 小鼠皮損中IL-36家族mRNA水平檢測

比較模型組與對照組IL-36α、IL-36β、IL-36γ及IL-36Ra mRNA水平，結(jié)果顯示模型組中IL-36β、36γ的表達(dá)明顯高于對照組(IL-36β：4.85±0.42 vs 1.00±0.13，t=14.74，P＜0.01；IL-36γ：3.89±0.71 vs 1.00±0.06，t=11.64，P＜0.01)，而IL-36α、IL-36Ra無明顯變化。比較實(shí)驗(yàn)組與模型組，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-36β表達(dá)下降(1.85±0.28 vs 4.85±0.42，t=8.01，P＜0.01)，而IL-36α、IL-36γ及IL-36Ra的mRNA水平無明顯改變(圖4)。

圖4 小鼠背部皮損中IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36Ra的mRNA相對表達(dá)水平Figure 4 Relative expression levels of IL-36α，IL-36β，IL-36γand IL-36Ra mRNA．

2.4 小鼠皮損IL-36β免疫組化檢測

IL-36β在對照組中僅少量表達(dá)于真皮層；在模型組中大量表達(dá)于顆粒層以及棘層中上部的細(xì)胞胞核和胞漿，且真皮層也有少量分布；在實(shí)驗(yàn)組中少量表達(dá)于真皮層，并少量或無表達(dá)于表皮層(圖5)。

圖5 用藥7 d后小鼠背部皮損IL-36β免疫組化(200×)Figure 5 Immunohistochemical staining of IL-36βin skin lesions after 7 days of treatment(200×)．

2.5 小鼠皮損中IL-36β蛋白水平的改變

結(jié)果顯示(圖6)，模型組IL-36β的表達(dá)(3.27±0.32)明顯高于實(shí)驗(yàn)組(2.50±0.24)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.31，P＜0.05)。

圖6 各組小鼠背部皮損中IL-36β的蛋白表達(dá)Figure 6 Expression of IL-36βprotein in skin lesions．

3 討論

隨著研究的深入，學(xué)者們對銀屑病的發(fā)病機(jī)制有了更加深入的認(rèn)識(shí)，大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明除了遺傳因素外，其發(fā)病主要有自身免疫及自身炎癥因素介導(dǎo)［9］。在某些物理、化學(xué)因素或藥物刺激等情況下，機(jī)體釋放大量炎癥介質(zhì)，適應(yīng)性免疫細(xì)胞(T細(xì)胞)、天然免疫細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)和角質(zhì)形成細(xì)胞之間的反饋回路被激活，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)被進(jìn)一步放大［10］，多種炎癥細(xì)胞在表皮及真皮聚集，從而產(chǎn)生銀屑病病理表現(xiàn)。

到目前為止，針對各種炎癥通路的生物制劑已大量面世，明顯提高銀屑病的治療效果，但部分患者由于經(jīng)濟(jì)條件或者有生物制劑禁忌癥，因此需選擇低毒、有效的重要制劑使用。養(yǎng)血解毒湯在臨床治療中取得了良好的療效，主要應(yīng)用于血燥型銀屑病，血燥型相當(dāng)于尋常型銀屑病的靜止期、緩解期，患者表現(xiàn)為口干咽燥，舌質(zhì)淡、苔薄白、脈緩或沉。養(yǎng)血解毒湯以當(dāng)歸、雞血藤養(yǎng)血活血潤膚，土茯苓解毒祛濕，生地、拳參、丹參清熱涼血，加入天冬、麥冬養(yǎng)陰生津，體現(xiàn)出養(yǎng)血潤燥、涼血解毒的主要治則［11］。不少研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)血解毒湯對銀屑病有良好的療效，并能使銀屑病相關(guān)免疫調(diào)節(jié)因子趨于正常［12-14］。本研究使用時(shí)隨證加減，選用純藥成份顆粒制劑溶解后于皮損處外用。

IL-36是一群結(jié)構(gòu)相似和功能相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子，主要包括IL-36α、IL-36β、IL-36γ和IL-36Ra。IL-36(α、β、γ)與IL-36受體特異性結(jié)合，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使跨膜受體胞內(nèi)段Toll樣受體(Toll/IL-1 receptor domain，TIR)結(jié)構(gòu)域改變，進(jìn)一步招募細(xì)胞內(nèi)髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，從而激活NF-κB通路和MAPKs通路［15］，繼而發(fā)揮促炎作用。有研究比較皮炎濕疹患者與銀屑病患者的皮膚組織，發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損組織中IL-36水平明顯高于皮炎患者皮膚組織［3］。另外，與正常人相比，銀屑病患者血清IL-36水平亦有升高，與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［16］。

本研究通過使用5%咪喹莫特乳膏建立銀屑病樣小鼠模型，自建模第2天起模型小鼠背部即出現(xiàn)銀屑病樣皮損改變，并逐日加重，在第8天銀屑病樣改變最明顯，成模時(shí)間與國內(nèi)馮艷等［17］描述相似。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠外涂養(yǎng)血解毒湯，觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠銀屑病樣改變逐漸減輕，在第8天實(shí)驗(yàn)組小鼠皮損PASI評(píng)分明顯低于模型組，再次驗(yàn)證了養(yǎng)血解毒湯對銀屑病的治療療效。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠皮損無明顯銀屑病樣改變，僅出現(xiàn)表皮增厚，且厚度明顯薄于模型組，說明養(yǎng)血解毒湯能抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的過度增殖和角化不全，降低銀屑病皮損的嚴(yán)重程度。對IL-36 mRNA水平及蛋白水平的檢測發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用養(yǎng)血解毒湯后，小鼠皮膚中IL-36β表達(dá)明顯降低，提示養(yǎng)血解毒湯對銀屑病樣皮損的影響主要通過IL-36β/IL-36R通路來調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究證實(shí)了在銀屑病樣小鼠中使用養(yǎng)血解毒湯可明顯減輕銀屑病皮損的嚴(yán)重程度，其機(jī)制與IL-36β相關(guān)；為養(yǎng)血解毒湯治療銀屑病的理論依據(jù)帶來了新發(fā)現(xiàn)，但其更詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。