李青雯，劉守剛，林靜霞，陳永鋒

1.南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚疾病，其主要特征是角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖和炎癥介質(zhì)(包括促炎細(xì)胞因子)的產(chǎn)生［1-2］。近年來，青黛膏作為臨床治療銀屑病的常用方劑，對(duì)銀屑病具有顯著療效［3-4］，其治療銀屑病的作用得到了越來越多的關(guān)注，但治療機(jī)制卻不完全清楚。為探究青黛膏治療銀屑病的機(jī)制，本研究采用青黛膏的主要成分靛玉紅刺激HaCaT細(xì)胞，了解其對(duì)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源與試劑

人類永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞(上海冉再生物科技有限公司)。靛玉紅(北京索萊寶科技有限公司)，Human IL-1βELISA Kit(Raybiotech，廣州)，Human IL-6 ELISA Kit(Raybiotech，廣州)，Human TNF-αELISA Kit(Raybiotech，廣州)，DMEM(美國(guó)Thermo Scientific公司)，胎牛血清(美國(guó)Thermo Scientific公司)，胰酶(美國(guó)Thermo Scientific公司)，上下游引物(上海生工)，PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)，TB Green? Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)，Bulk(Takara，日本)。

1.2 主要儀器

NanoDrop One分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)，ABI ProFlex PCR系統(tǒng)梯度基因擴(kuò)增儀(上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司)，CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corpo-Ration，Steri-cycle CO2Incubator)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HaCaT細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)、鋪板復(fù)蘇HaCaT細(xì)胞，完全培養(yǎng)基(90% DMEM+10% FBS)培養(yǎng)細(xì)胞，在37℃、5%CO2條件的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，棄除舊培養(yǎng)基后用PBS洗滌細(xì)胞，加入3 mL胰蛋白酶消化細(xì)胞，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育6 min，待細(xì)胞分離后加入3倍胰酶體積(約9 mL)含血清的新鮮培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，以1 000 rpm/min的速度離心5 min，棄上清后加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)/mL，準(zhǔn)備好2塊6孔板，每孔加入1 mL重懸的細(xì)胞懸液均勻鋪板，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 靛玉紅處理細(xì)胞待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)4～6 h后，按照以下分組加入靛玉紅或DMEM培養(yǎng)基：A組(對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔)僅加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)基，B、C、D組(實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)復(fù)孔)分別加入0.5μM、1.0μM、2.0μM濃度的靛玉紅(用DMEM稀釋)，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 RT-qPCR檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、qPCR反應(yīng)。qPCR反應(yīng)總體系25μL，含12.5μL TB Green Premix Ex TaGⅡ、2μL cDNA、8.5μL DEPC水、前后引物各1μL，反應(yīng)條件為：95℃3 min；95℃10 s，56℃30 s，75℃30 s，共40個(gè)循環(huán)；65℃5 s、95℃50 s，繪制融解曲線。反應(yīng)結(jié)束后，分析反應(yīng)的擴(kuò)增曲線及融解曲線無異常后，使用2-ΔΔCT法計(jì)算出各組細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 ELISA檢測(cè)HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書操作，最后在酶標(biāo)儀中讀取各孔在450 nm波長(zhǎng)處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果至少經(jīng)三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)計(jì)算得出。不同濃度靛玉紅處理組與對(duì)照組之間IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平及細(xì)胞因子分泌水平的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靛玉紅對(duì)HaCaT細(xì)胞中各促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響

與A組相比較，B、C、D組HaCaT細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。且隨著靛玉紅濃度的升高，該抑制作用增強(qiáng)，呈一定的濃度依賴性。

圖1 靛玉紅處理后各組IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平Figure 1 Expression levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αmRNA in each group after indirubin treatment．

2.2 靛玉紅對(duì)HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液中各促炎細(xì)胞因子分泌水平的影響

與A組相比較，B、C、D組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。且隨著靛玉紅濃度的升高，該抑制作用增強(qiáng)，呈一定的濃度依賴性。

圖2 靛玉紅處理后各組IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平Figure 2 Secretion levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αin each group after indirubin treatment．

3 討論

銀屑病是一種多基因遺傳背景下、免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，其主要特征是角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖分化和炎癥介質(zhì)包括促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［5-6］。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚組織相比，銀屑病患者皮損中促炎細(xì)胞因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平明顯升高［7-8］。IL-6主要是由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，其表達(dá)水平增高會(huì)導(dǎo)致Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞之間的平衡失調(diào)從而參與銀屑病的發(fā)?。?］。IL-1β是由活化的單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生，通過與IL-1受體結(jié)合后發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)炎癥的作用，參與了銀屑病典型皮損的形成［10］。TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。TNF-α抑制劑是一種治療銀屑病的有效生物制劑，包括了阿達(dá)木單抗、英夫利昔單抗等，已在臨床上廣泛應(yīng)用［11］。

銀屑病，中醫(yī)稱之為“白疕”，臨床辨證中多從血論治，而尤以血熱證多見［12］。根據(jù)中醫(yī)“清熱涼血”的理論，經(jīng)臨床總結(jié)、摸索，青黛膏(由青黛、白凡士林組成)可以有效用于治療本病。青黛具有清熱解毒、涼血消斑之功，是臨床上用于治療銀屑病的常用中藥，具有明確的療效［13-14］。Lin等［3］研究發(fā)現(xiàn)，青黛通過抑制表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖并促進(jìn)其分化從而發(fā)揮治療銀屑病的作用，并且鑒定了靛玉紅是其發(fā)揮作用的主要活性成分。HaCaT細(xì)胞是人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株，與角質(zhì)形成細(xì)胞具有相似的增殖、分化特性，且具有永生性，與銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖分化的病理特征相似。前期研究觀察到，青黛的主要成分靛玉紅具有抑制HaCaT細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并且可以通過降低HaCaT細(xì)胞中角蛋白17的表達(dá)發(fā)揮調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞分化、改善異常分化的作用［15］。本研究選取HaCaT細(xì)胞作為研究對(duì)象，在體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞株中加入青黛的主要活性成分靛玉紅，設(shè)置不同的濃度梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同濃度的靛玉紅處理后，HaCaT細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平及培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平均受到明顯抑制，并且隨著靛玉紅濃度的升高，該抑制作用增強(qiáng)，呈一定的濃度依賴性。研究結(jié)論進(jìn)一步驗(yàn)證了前人研究結(jié)果，提示靛玉紅可能通過調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖及分化過程從而發(fā)揮治療銀屑病的作用。

綜上所述，青黛膏的主要活性成分靛玉紅可能通過降低HaCaT細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等銀屑病相關(guān)炎性因子的水平，從而發(fā)揮治療銀屑病的作用，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步的動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。