韓帥兵，張耀中，于 淼，薛 雯，李向陽，吳亞玉，周 力

(山東省農(nóng)藥檢定所， 山東 濟(jì)南 250100)

隨著廣大人民群眾及政府部門對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重視程度的不斷加強(qiáng)，各檢測(cè)機(jī)構(gòu)承接的農(nóng)產(chǎn)品中尤其是蔬菜水果中農(nóng)藥殘留檢測(cè)任務(wù)不斷增加，如何提供更加科學(xué)、準(zhǔn)確的檢測(cè)數(shù)據(jù)也成為各實(shí)驗(yàn)室關(guān)注的焦點(diǎn)。測(cè)量不確定度代表著檢測(cè)值的可信區(qū)間，是衡量實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量的重要指標(biāo)，尤其是檢測(cè)結(jié)果在限量臨界值區(qū)間時(shí)，不確定度更是合格性判定的重要參考依據(jù)[1-3]。因此，不確定度的評(píng)定逐漸受到各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的重視。隨著不確定度評(píng)定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及指南的更新或發(fā)布[4-5]，不確定度的評(píng)定更加有據(jù)可循，測(cè)量不確定度的評(píng)定工作也相應(yīng)成為各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的重要一環(huán)。當(dāng)前，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法作為一種應(yīng)用越來越普遍的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，關(guān)于它的測(cè)量不確定度評(píng)定的研究雖有所報(bào)道[6-8]，但這些報(bào)道大多不是建立在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法之上，對(duì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室具體工作參考意義有限。

2021年3月，新的國家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.121-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中331種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》發(fā)布[9]，此方法是建立在QuEChERS方法基礎(chǔ)上的多殘留檢測(cè)方法，與原國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20769-2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[10]相比，該方法用料量少、操作簡(jiǎn)便，且涉及了很多原標(biāo)準(zhǔn)未涉及的農(nóng)藥代謝物，一定程度上來說，可以替代原國標(biāo)。這兩種檢測(cè)方法在前處理步驟上存在明顯差異，那么，在測(cè)量不確定度的評(píng)定過程及結(jié)果上是否也存在明顯差異，目前還沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究以檢測(cè)大白菜中吡蟲啉殘留量為例，按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的具體操作步驟及計(jì)算方法進(jìn)行檢測(cè)，依據(jù)不確定度評(píng)定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及指南[4-5]，分別評(píng)定了在相同檢測(cè)條件下，兩種檢測(cè)方法測(cè)量結(jié)果的不確定度，比較了二者在不確定度組成、最終結(jié)果、貢獻(xiàn)度分布及關(guān)鍵因素上的區(qū)別，并分析了產(chǎn)生原因，為標(biāo)準(zhǔn)方法的比較提供了數(shù)據(jù)依據(jù)，同時(shí)也為農(nóng)藥殘留檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室提供了不確定評(píng)定的參考范例。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與材料 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(ESI)；氮吹儀(N-EVAP112)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10 Control)；移液器；石墨炭黑氨基SPE小柱(Carbon/NH2SPE，500mg，6mL)；0.22μm有機(jī)濾膜、量筒、容量瓶等。

1.2 主要試劑 乙腈，色譜純；甲醇，色譜純；甲苯，分析純；氯化鈉，分析純；無水硫酸鎂，分析純；檸檬酸鈉，分析純；檸檬酸氫二鈉，分析純。

1.3 樣品前處理 樣品分別按照兩種標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行前處理。

1.3.1 GB/T 20769-2008前處理 提?。簻?zhǔn)確稱取20g(精確至0.01g)樣品于80mL離心管中，加入40mL乙腈，15 000r/min下勻漿1min，加入5g NaCl再勻漿1mL，離心后取上清液10mL，40℃氮吹至1mL后待凈化。

凈化：用5mL的V(乙腈) ： V(甲苯)= 3：1混合液預(yù)淋Carbon/NH2柱后，加入待凈化液，用2mL上述混合液分3次洗滌離心管，將洗滌液轉(zhuǎn)入柱中，再用25mL淋洗液洗脫，收集所有洗脫液，旋轉(zhuǎn)濃縮近干，用5mL乙腈定容，過0.22μm有機(jī)濾膜后待測(cè)。

1.3.2 GB 23200.121-2021前處理 提?。簻?zhǔn)確稱取10g(精確至0.01g)樣品于50mL離心管中，加入10mL乙腈、4g無水硫酸鎂、1g氯化鈉、1g檸檬酸鈉、0.5g檸檬酸氫二鈉及1顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，劇烈震蕩1min 后4 200r/min離心5min。

凈化：吸取6mL上清液至內(nèi)含900mg無水硫酸鎂、150mgPSA的離心管中，渦旋混勻1min。4 200r/min離心5min，吸取上清液過0.22μm有機(jī)濾膜后待測(cè)。

1.4 樣品檢測(cè) 前處理后的樣品經(jīng)UPLC-MS/MS檢測(cè)，兩種檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)采取相同的儀器方法，參考儀器條件如下：

色譜柱：Shim-pack XR-ODS Ⅲ(2.0mm I.D.×50mm，1.6μm)

流動(dòng)相：A：甲醇，B：5 mM醋酸銨+0.02%甲酸水溶液；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：0.5μL

流速及梯度：(表1)

表1 流動(dòng)相流速及梯度設(shè)置

質(zhì)譜儀條件：離子源：ESI源，正離子模式；檢測(cè)方式：MRM；電離電壓：4.5kV；碰撞氣及壓力：Ar，0.23MPa；霧化氣流速：3.0L/min；檢測(cè)器電壓：1.74kV；干燥氣流速：10.0mL/min；加熱氣流速：10.0mL/min；定量離子：256.10-209.10，碰撞電壓-14V；定性離子：256.10-175.10，碰撞電壓-16V。

1.5 數(shù)學(xué)模型的建立 根據(jù)兩種檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法，兩種方法的殘留量(mg/kg)計(jì)算分別見公式(1、2)。

(1)

(2)

其中，公式(1)為GB/T 20769-2008計(jì)算公式，公式(2)為GB 23200.121-2021計(jì)算公式。式中，ω為樣品中被測(cè)農(nóng)藥組分的含量(mg/kg)；Ai為樣品中被測(cè)農(nóng)藥組分的峰面積；As為標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測(cè)農(nóng)藥組分的峰面積；V1為提取溶液總體積(mL)；V2為吸取出用于檢測(cè)的提取溶液體積(mL)；V3為樣品定容體積(mL)；m為樣品取樣量(g)；ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液中農(nóng)藥的含量(mg/L)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不確定度來源分析 通過對(duì)檢測(cè)過程的分析，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)都有4個(gè)主要步驟：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、稱樣、前處理和上機(jī)檢測(cè)，據(jù)此可將引入不確定度的來源細(xì)化為：所購買標(biāo)準(zhǔn)溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、稱樣、前處理過程、儀器穩(wěn)定性。另外，在實(shí)際檢測(cè)工作中，還需要考慮方法精密度對(duì)測(cè)定結(jié)果的系統(tǒng)性影響，由此可以得到不確定度來源分析魚骨圖(圖1)。

圖1 不確定度來源分析魚骨圖

其中，對(duì)于GB 23200.121-2021來說，樣品前處理過程中并不包含分取和定容的過程。綜合公式(1、2)及(圖1)，可以判定檢測(cè)結(jié)果的不確定度主要來源包括：標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(ρ)，樣品進(jìn)樣峰面積(Ai)，標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積(As)，樣品的最終定容體積(V)，樣品稱樣量(m)及方法精密度(frec)，由此可根據(jù)公式(3)得到合成不確定度urel(ω)：

即：urei(ω)=

(3)

2.2 相對(duì)不確定度的評(píng)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度 兩種檢測(cè)方法所用標(biāo)準(zhǔn)溶液均為用購買的吡蟲啉有證標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋后得到，因此，由標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度是相同的，包括所購標(biāo)準(zhǔn)溶液urel(ρ1)和配制過程引入urel(ρ2)，均為B類評(píng)定。

2.2.1.1 購買標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度 本研究所購買吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為1 000mg/L，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書顯示其擴(kuò)展不確定度為7mg/L(包含因子k=2)，則所購標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)不確定度為：urel(ρ1)=0.35%。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度 本研究最終所用質(zhì)量濃度為0.2mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液是使用質(zhì)量濃度為1 000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈2次稀釋后配制而得：先用1mL A級(jí)分度吸量管移取0.25mL 1 000mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈定容到25mL，配制得1.0mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液；再用1mL A級(jí)分度吸量管移取1.0mL 1.0mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白樣品溶液定容到5mL，得到0.2mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程中，引入不確定度的因素應(yīng)該包括溫度變化對(duì)試劑膨脹的影響，及配制過程中所使用玻璃儀器的允差及讀數(shù)誤差。

實(shí)驗(yàn)室溫度一般控制在(20±5)℃，乙腈的膨脹系數(shù)為0.001 37℃-1，服從矩形分布，由此，由溫度效應(yīng)引入的相對(duì)不確定度可由公式(4)計(jì)算而得：

(4)

配制過程中所用玻璃儀器引入的不確定度主要由允差和讀數(shù)重復(fù)性偏差組成，每個(gè)分量可用公式(5)計(jì)算：

(5)

式中aL為玻璃儀器的最大允許誤差或讀數(shù)重復(fù)性偏差，其中，1mL A級(jí)分度吸量管精度較高，讀數(shù)重復(fù)性引入不確定度可以忽略不計(jì)，允許誤差為±0.008mL[11]；25mL容量瓶允許誤差為±0.03mL，重復(fù)性偏差為±0.01mL；5mL容量瓶允許誤差為±0.02mL，重復(fù)性偏差為±0.01mL；服從三角形分布，k取 ；V為所用體積。由此，在標(biāo)準(zhǔn)溶液配置過程中每次使用玻璃儀器由誤差、偏差及溫度引入的不確定度(表2)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中玻璃儀器使用引入的不確定度

將上述不確定度合并，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度urel(ρ2)公式(6)。

(6)

據(jù)此，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液所引入的不確定度urel(ρ)公式(7) 。

(7)

2.2.2 樣品稱量引入的不確定度 本研究中，兩種檢測(cè)方法稱樣時(shí)所用天平相同，均為精度為0.01g電子天平，樣品均勻性及稱量重復(fù)性引入不確定度均可忽略不計(jì)。該級(jí)別天平在量程內(nèi)允許的最大誤差為±0.01g，則由稱量誤差引入的不確定度服從矩形分布(B類評(píng)定)，兩種方法稱樣量有所不同，則GB/T 20769-2008中由稱量引入不確定度urel(mⅠ)計(jì)算公式(8)，GB 23200.121-2021中由稱量引入不確定度urel(mⅡ)計(jì)算公式(9)。

(8)

(9)

2.2.3 樣品前處理引入的不確定度 前處理所引入的不確定度主要來源于添加提取試劑、移取及凈化后定容時(shí)的玻璃器皿的允差及溫度變化引起試劑膨脹，均為B類評(píng)定。

2.2.3.1 GB/T 20769-2008前處理引入的不確定度 由1.3.1可知，對(duì)于GB/T 20769-2008來說，可以引入不確定度的步驟所用器皿包括：添加40mL乙腈所用50mL量筒，允許誤差為±0.50mL，讀數(shù)重復(fù)性偏差為±0.10mL；移取提取液所用10mL單標(biāo)線吸量管，A級(jí)允許誤差為±0.020mL，讀數(shù)重復(fù)性偏差可以忽略；最終定容所用5mL單標(biāo)線吸量管，A級(jí)允許誤差為±0.015mL，讀數(shù)重復(fù)性偏差可以忽略，均服從三角分布。應(yīng)用公式(4、5)可計(jì)算在前處理過程中每次使用玻璃儀器由誤差、偏差及溫度引入的不確定度(表3)。

表3 GB/T 20769-2008前處理過程玻璃儀器使用引入不確定度

將上述不確定合并，得到前處理過程引入的不確定度urel(VⅠ)公式(10)。

(10)

2.2.3.2 GB 23200.121-2021前處理引入的不確定度 由1.3.2可知，對(duì)于GB 23200.121-2021來說，可以引入不確定度的步驟所用器皿只有在加入10mL乙腈時(shí)所用規(guī)格為10mL的量筒，其允許誤差為±0.10mL，讀數(shù)重復(fù)性偏差為±0.02mL；雖然在后續(xù)步驟中有提取液的取用，但這一步驟并不需精確量取，且不參與最終結(jié)果的計(jì)算，由此可以計(jì)算前處理過程引入的不確定度urel(VⅡ)公式(11)。

(11)

2.2.4 儀器檢測(cè)引入的不確定度 由2.1可知，儀器檢測(cè)引入的不確定度可以分為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積引入的不確定度和樣品溶液峰面積引入的不確定度。由于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀靈敏度較高，可以認(rèn)為儀器穩(wěn)定性即測(cè)定值的分散性就是構(gòu)成測(cè)量峰面積的不確定度的主要來源，其他因素可以忽略不計(jì)。此類不確定度可以在重復(fù)性條件下對(duì)同一被測(cè)量對(duì)象獨(dú)立重復(fù)觀測(cè)多次，最后采用統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行計(jì)算，即進(jìn)行A類評(píng)定。在重復(fù)性條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品進(jìn)行分別進(jìn)樣6次，得到6次進(jìn)樣的峰面積，根據(jù)貝塞爾公式(12)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度根據(jù)公式(13)計(jì)算。

(12)

(13)

根據(jù)方法(1、2)的標(biāo)樣溶液和樣品峰面積檢測(cè)結(jié)果，分別計(jì)算得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(表4)。

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品峰面積檢測(cè)結(jié)果及不確定度(n=6)

2.2.5 方法精密度引入的不確定度 由方法精密度引入的不確定度符合A類評(píng)定，本研究通過檢測(cè)多個(gè)空本樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行評(píng)定。按照GB/T 20769-2008及GB 23200.121-2021的稱樣量分別制備5個(gè)添加樣品并在重復(fù)性條件下進(jìn)行檢測(cè)，添加濃度均為0.2mg/kg，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用公式(12、13)計(jì)算相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差及標(biāo)準(zhǔn)不確定度，最終計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度(表5)。

表5 添加回收樣品檢測(cè)結(jié)果及不確定度(n=5)

2.2.6 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成 綜合上述得到的各不確定度分量，通過公式(3)可計(jì)算得到兩個(gè)方法的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ω)，具體各分量不確定度及合成相對(duì)不確定度計(jì)算結(jié)果(表6)。

表6 各分量不確定度及合成相對(duì)不確定度

由結(jié)果可知，對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)來說，兩種方法的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度均比較低，但依舊存在一定的差異，GB/T 20769-2008明顯高于GB 23200.121-2021，主要差別出現(xiàn)在方法精密度上，其他分量引入的不確定度相差并不多。分析原因應(yīng)該是由于GB/T 20769-2008的前處理步驟相對(duì)復(fù)雜，需要經(jīng)過濃縮—凈化—濃縮—定容等一系列操作，造成方法精密度較方法二更低，從而提高了不確定度。

對(duì)于每個(gè)分量對(duì)合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的貢獻(xiàn)度而言，GB/T 20769-2008結(jié)果中，貢獻(xiàn)度最高的是方法精密度(51.7%)和標(biāo)準(zhǔn)溶液(33.1%)；其他分量的貢獻(xiàn)度都較低；GB 23200.121-2021結(jié)果中貢獻(xiàn)度最高的是標(biāo)準(zhǔn)溶液(64.3%)，其他各分項(xiàng)貢獻(xiàn)度相對(duì)較低且比較平均。由此可見，對(duì)于兩種檢測(cè)方法來說，標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度都是影響檢測(cè)結(jié)果不確定度的關(guān)鍵因素，而對(duì)于GB/T 20769-2008來說，精密度則是另一個(gè)關(guān)鍵因素。

雖然從本次實(shí)驗(yàn)的評(píng)定結(jié)果來看，在不確定度的表現(xiàn)上，GB 23200.121-2021確實(shí)優(yōu)于GB/T 20769-2008，但這一結(jié)果僅是反應(yīng)吡蟲啉一種農(nóng)藥在大白菜這一種基質(zhì)中的情況，并不能得到標(biāo)準(zhǔn)所涉及的所有農(nóng)藥在各種基質(zhì)中均符合這一規(guī)律的結(jié)論。這是因?yàn)?，兩種檢測(cè)方法樣品的最終凈化效果是差別較大的，GB/T 20769-2008對(duì)樣品的凈化效果要明顯優(yōu)于GB 23200.121-2021，在這種情況下，對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)，比如含色素較多的綠色蔬菜，含其他雜質(zhì)較多的鱗莖類蔬菜等，GB 23200.121-2021是否還能保持優(yōu)于GB/T 20769-2008的精密度，進(jìn)樣溶液雜質(zhì)的增多是否會(huì)影響儀器檢測(cè)峰面積的重復(fù)性等，這些因素都會(huì)影響最終不確定度的評(píng)定結(jié)果，還需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)具體分析。

2.3 檢測(cè)結(jié)果擴(kuò)展不確定度的表示 根據(jù)測(cè)量不確定度評(píng)定指南對(duì)一般實(shí)驗(yàn)室的要求，在置信概率p=95%時(shí)，取測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度包含因子k=2，由此得到，對(duì)于一個(gè)吡蟲啉在大白菜樣品中殘留量的檢測(cè)結(jié)果為MRL值[12](0.2mg/kg)附近的樣品來說，用標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 20769-2008和GB 23200.121-2021分別進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果的相對(duì)擴(kuò)展不確定度分別為5.6%和4.0%。

3 結(jié)論

本研究評(píng)定了使用兩種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)吡蟲啉在大白菜中殘留量時(shí)結(jié)果的不確定度。通過實(shí)驗(yàn)及計(jì)算可知，由于檢測(cè)方法更加簡(jiǎn)便易行，方法重現(xiàn)性更好，新檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.121-2021的結(jié)果不確定度要小于原方法GB/T 20769-2008。但是，本研究只針對(duì)吡蟲啉一種農(nóng)藥在大白菜基質(zhì)中，對(duì)于更多種農(nóng)藥在其他基質(zhì)尤其是復(fù)雜基質(zhì)中的不確定度是否符合這一規(guī)律還有待更進(jìn)一步的研究。