林慧，劉英，文平，胡素熔，段金良

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二四醫(yī)院生殖中心，桂林 541002)

2016年7月，國際胚胎植入前遺傳學診斷協(xié)會(PGDIS)修改之前所提的胚胎植入前遺傳學篩查(PGS)指南，第一次允許選擇性移植嵌合體胚胎[1-2]。同時，PGS也更名為胚胎植入前遺傳學非整倍體檢測(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)。這些變化，至少在某種程度上，是對發(fā)表在2015年的兩個關于移植“不正常”胚胎后出生健康活產(chǎn)嬰兒報告的回應[3-4]。近幾年來，國外有部分關于移植嵌合體胚胎、“不正?！迸咛サ膱蟮繹5-6]，然而關于囊胚滋養(yǎng)外胚層細胞嵌合胚胎移植的結局尚存在爭議，有文獻報道囊胚滋養(yǎng)外胚層細胞嵌合程度不是預測持續(xù)妊娠率和流產(chǎn)率的良好指標[7]。目前，國內幾乎無移植嵌合體胚胎的報道，本研究總結我中心近兩年來的相關數(shù)據(jù)，現(xiàn)報道如下。

一、資料與方法

1.研究對象：選取2018年4月至2020年11月于本院生殖中心行PGT-A的患者。這些患者經(jīng)取卵、授精后將胚胎培養(yǎng)至囊胚期進行滋養(yǎng)層細胞活檢，采用基于染色體拷貝數(shù)變異的二代測序方法檢測。有少部分患者無整倍體胚胎，患者知情同意后選擇移植嵌合體胚胎。移植前所有患者(n=14)均經(jīng)過遺傳咨詢且簽署高通量測序知情同意書以及胚胎解凍知情同意書。

納入標準：女方高齡(≥38歲)；反復自然流產(chǎn)(≥2次)；反復著床失??；染色體異常(易位、倒位等)，滿足以上1條即可。排除標準：子宮解剖結構異常；內分泌疾病；自身免疫性疾病；子宮內膜異位癥。

2.囊胚檢測及凍融移植：(1)囊胚活檢：囊胚評分參考Gardner 評分系統(tǒng)[8]，本中心活檢的胚胎均為D5或D6囊胚(3～4期，內細胞團和滋養(yǎng)層評分在B級以上)。當囊胚達到活檢標準時，在內細胞團對側用激光儀在透明帶上打孔，將囊胚繼續(xù)培養(yǎng) 2～4 h。活檢時，取外滋養(yǎng)層細胞5～10 個左右，經(jīng)培養(yǎng)液洗滌后放入事先裝有2.5 μl PBS緩沖液的PCR管內，離心后于-20℃冰箱凍存待檢?；顧z后囊胚采用玻璃化冷凍法保存于液氮中。(2)PGT-A檢測：采用PicoPLEX方法將待測樣本進行單細胞全基因組擴增，按操作步驟進行，放入設定好參數(shù)的 PCR 儀中，先裂解細胞，隨后經(jīng)過預擴增，最后經(jīng)過指數(shù)擴增，用Qubit 3.0將擴增后的產(chǎn)物定量；片段選擇；構建文庫并將構建好的文庫純化后定量；模板制備與富集：測序文庫與乳液PCR緩沖液、乳液PCR酶混合液、模板載體溶液構建“油包水” PCR 反應單元；在DA8600 測序平臺完成測序工作；采用“遺傳學檢測分析管理系統(tǒng)”對測序數(shù)據(jù)進行分析。(3)凍融胚胎移植：采用人工周期的方法準備內膜，子宮內膜厚度≥8 mm時轉化內膜，移植日將經(jīng)PGT-A檢測后的可移植的嵌合體胚胎玻璃化解凍，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后移植。

3.妊娠判定及隨訪：移植后第14天檢測血β-HCG，移植后第28天陰道B超探及妊娠囊為臨床妊娠。生殖中心隨訪專職護士通過電話方式對患者進行隨訪，包括HCG結果、B超情況、羊水穿刺結果及胎兒出生情況等。

4.觀察指標：經(jīng)過高通量測序檢測，分析14例嵌合體胚胎的檢測結果及解凍移植后的臨床妊娠率及流產(chǎn)率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%，流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

5.統(tǒng)計學方法：計數(shù)資料采用率(%)進行統(tǒng)計學描述。

二、結果

1.嵌合體胚胎的高通量測序結果：14例嵌合體胚胎涉及1條或2條染色體的嵌合，嵌合的形式為單體、部分片段單體、部分片段三體嵌合，以部分片段單體嵌合為主(表1)。

表1 嵌合體胚胎的高通量測序結果

2.嵌合體胚胎移植后的妊娠結局：14例移植嵌合體胚胎的患者中，有6例臨床妊娠。其中2例已分娩，出生嬰兒身體健康，外觀無異常；有3例已行產(chǎn)前診斷，胎兒染色體正常；1例于孕8周胚胎停育。嵌合體胚胎移植的著床率和臨床妊娠率均為42.86%(6/14)，流產(chǎn)率為16.67%(1/6)(表2)。

表2 嵌合體胚胎移植后的妊娠結局

三、討論

1.胚胎嵌合體：隨著生殖遺傳學技術的發(fā)展，用于PGT-A的技術主要有熒光原位雜交技術(FISH)、微陣列比較基因組雜交(aCGH)、微陣列單核苷酸多態(tài)性(aSNP)、定量PCR(qPCR)、二代測序(NGS)等。檢測方法不同，嵌合檢出率也不同。

隨著PGT-A技術的廣泛使用，研究發(fā)現(xiàn)移植整倍體胚胎可以提高IVF臨床妊娠結局[9]。在IVF獲得的胚胎中，染色體嵌合較為常見，被認為是一些整倍體胚胎移植后失敗的可能原因之一[10]。盡管卵裂期胚胎的嵌合已有報道[11]，但其在囊胚期的發(fā)生率尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)小鼠囊胚期發(fā)生嵌合現(xiàn)象可以被自我糾正[12]，盡管這一現(xiàn)象最初并不被PGS/PGT-A組織廣泛接受[13]，但是Munné[14]認為這種自我修正增加的可能性在人類胚胎也有發(fā)生。如果事實確實如此，那么PGS/PGT-A在囊胚階段的檢測將沒有任何意義，因為胚胎在發(fā)育階段的情況并不反映胚胎最終的命運。

人類囊胚期胚胎滋養(yǎng)外胚層嵌合現(xiàn)象仍然是目前研究的熱點。單個胚胎多重滋養(yǎng)外胚層活檢顯示嵌合率至少有50%，最高可達83%[3，15-16]。相同的胚胎，不同實驗室及活檢部位不同，得到的結果差異也較大[15]。國外一項運用aCGH技術進行胚胎檢測的回顧性研究顯示，移植嵌合體胚胎與整倍體胚胎相比，臨床妊娠率下降(26.9% vs. 40.2%)，但無統(tǒng)計學差異(P=0.127)[17]。Munné等[18]的回顧性研究顯示，復雜的嵌合體胚胎與非整倍體嵌合胚胎相比，有更低的繼續(xù)妊娠率(10% vs. 50%)；而相比于嵌合率小于40%的胚胎，嵌合率為40%～80%的胚胎其繼續(xù)妊娠率更低(22% vs. 56%)；單體嵌合與三體嵌合之間、整條染色體嵌合與部分片段嵌合之間沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。相對于嵌合體胚胎移植而言，移植整倍體胚胎的植入率更高、流產(chǎn)率更低、繼續(xù)妊娠率也更高。Spinella等[19]的研究顯示，與整倍體囊胚相比，異常細胞嵌合比例大于50%的囊胚其臨床妊娠率、著床率和活產(chǎn)率均降低。而另一研究顯示，44枚經(jīng)NGS檢測診斷的嵌合體囊胚中，染色體部分非整倍體嵌合比例低的囊胚與整倍體囊胚的妊娠結局無明顯差別[20]。在本研究中，嵌合體胚胎移植的臨床妊娠率和著床率均為42.86%，流產(chǎn)率為16.67%；在6例妊娠的患者中，有5例為部分片段嵌合，嵌合比例均小于50%，妊娠結局良好；而另1例為18號染色體單體嵌合，嵌合比例大于50%，孕8周胚胎停育。研究結果存在一定差異可能是由于病例數(shù)較少造成的。

2.囊胚質量及發(fā)育速度與妊娠結局：國內外的研究認為臨床妊娠率與囊胚腔擴張程度及內細胞團質量無關，而與滋養(yǎng)外胚層有關[21-22]。孟慶霞等[23]采用多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，影響流產(chǎn)率的兩個重要因素是內細胞團評分和囊胚發(fā)育天數(shù)，影響活產(chǎn)率的最重要因素是滋養(yǎng)外胚層評分；國外相關研究[24-25]也證實了這一觀點。柴娟等[26]的研究顯示，凍融囊胚D5組種植率和臨床妊娠率均高于D6組，而早期流產(chǎn)率比D6組低，均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。本研究中移植后妊娠的6例嵌合體囊胚中，5例為D5囊胚、1例為D6囊胚，且5例為4級囊胚，僅1例為3級囊胚，囊胚發(fā)育天數(shù)及擴張程度與妊娠率有一定關系。

Minasi等[27]的研究顯示囊胚內細胞團評分及囊腔擴張程度越高，整倍性囊胚的占比也越高，且D5囊胚有更高的整倍體率。孫健等[28]的研究也表明，PGS周期中D5比D6囊胚整倍體率稍高，但沒有顯著差異。Munné等[29]研究認為影響胚胎整倍體的因素很多，培養(yǎng)天數(shù)與胚胎整倍體率并無關系。Capalbo等[30]的雙中心研究顯示，形態(tài)等級及發(fā)育速度不影響整倍體囊胚的種植率，不同質量的整倍體囊胚獲得的持續(xù)妊娠率沒有顯著差異，該研究認為有必要對所有可利用的囊胚進行檢測。

3.PGT-A技術的局限性：在胚胎發(fā)育過程中，囊胚內細胞團組織發(fā)育為胎兒，滋養(yǎng)層細胞發(fā)育為胎盤及胎膜等附屬物。囊胚滋養(yǎng)層細胞活檢理論上不影響胎兒發(fā)育，所以該方法已成為了主流的活檢方法。事實上，內細胞團與滋養(yǎng)層細胞之間、滋養(yǎng)層不同部位的細胞之間可能并不一樣，因此胎盤部位的染色體結果并不能完全代表胎兒部分的情況。

活檢的細胞數(shù)要求5～10個，如果胚胎滋養(yǎng)層細胞質量差，活檢的細胞少，檢測結果的代表性就越差。另外，目前對于PGT-A，普遍采用低深度測序染色體拷貝數(shù)變異的NGS方法，因此低比例嵌合、小片段缺失及重復以及結構異常等不在檢測范圍內，需要孕中期產(chǎn)前診斷進一步行CNV-seq檢測，一旦檢測出異常，及時告知患者行遺傳咨詢。

總之，PGT-A技術并非無所不能。目前絕大多數(shù)的研究認為，嵌合體胚胎具有一定的發(fā)育潛能，盡管與整倍體胚胎相比，其臨床妊娠率較低，但在患者無整倍體胚胎可移植的情況下，經(jīng)遺傳咨詢告知相關風險后可選擇移植嵌合體胚胎，孕中期行產(chǎn)前診斷。PGDIS 在關于嵌合體胚胎遺傳咨詢指南中建議：(1)相較于二倍體-三倍體細胞系嵌合胚胎，優(yōu)先移植二倍體-單倍體細胞系嵌合胚胎；(2)當選擇移植二倍體-三倍體細胞系嵌合胚胎時，應根據(jù)嵌合的程度以及受累染色體選擇最優(yōu)胚胎，優(yōu)先考慮移植包括：1，3，4，5，6，8，9，10，11，12，17，19，20，22，X和Y染色體的三體嵌合；與單親二倍體(14，15號染色體)相關嵌合三體胚胎的優(yōu)先級較低；與宮內生長遲緩(2，7，16號染色體)相關嵌合三體胚胎的優(yōu)先級更低；能夠存活(13，18，21號染色體)的嵌合三體胚胎優(yōu)先級最低[31]。本研究的樣本量較少，對于子代安全性問題，還需要更大樣本的長期追蹤隨訪。