許浩麗，蔡桂豐，許偉標(biāo)，楊嫦玉，張麗娜

(珠海市婦幼保健院生殖中心,珠海 519001)

自從1985年人類第一例凍融胚胎移植(FET)健康嬰兒出生以來(lái)，F(xiàn)ET技術(shù)迅速發(fā)展，成為了人類輔助生殖技術(shù)重要的部分，可以避免新鮮周期超生理激素水平對(duì)妊娠結(jié)局的不良影響，并減少促排卵并發(fā)癥如卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)的風(fēng)險(xiǎn)等、增加取卵周期的累積成功率。越來(lái)越多的中心采用FET周期，而且獲得與鮮胚移植周期相當(dāng)?shù)某晒β省０▋?nèi)膜準(zhǔn)備方案在內(nèi)的眾多因素影響到FET周期的成功率。激素替代人工周期(HRT)方案簡(jiǎn)單、方便、經(jīng)濟(jì)，而且成功率較高，是FET周期最常用的準(zhǔn)備內(nèi)膜方法之一。本研究回顧性分析我中心于2019～2020年采用HRT方案準(zhǔn)備內(nèi)膜的FET周期(HRT-FET周期)的臨床資料，分析相關(guān)的影響因素，旨在為進(jìn)一步改善HRT-FET周期臨床結(jié)局提供數(shù)據(jù)積累和參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

2019年1月至2020年12月在珠海市婦幼保健生殖中心接受FET治療的不孕癥患者。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≤40歲；第一周期IVF/ICSI-ET助孕；全胚冷凍后第1次FET周期；HRT方案準(zhǔn)備內(nèi)膜；移植評(píng)分Ⅰ～Ⅱ級(jí)胚胎[1]。

二、診療回顧

1.子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備：所有患者于月經(jīng)第3天經(jīng)陰道B超檢查子宮內(nèi)膜厚度及排除子宮腔異常情況，比如子宮內(nèi)膜息肉等。如內(nèi)膜厚度>6 mm，或卵巢內(nèi)有>10 mm的液暗，在月經(jīng)周期第5天或第7天再次陰道B超檢查，如內(nèi)膜厚度≤6 mm，卵泡消失或縮小即啟動(dòng)HRT內(nèi)膜準(zhǔn)備，否則即取消周期，或更改內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。

內(nèi)膜準(zhǔn)備方案一：遞增方案。口服戊酸雌二醇(仙靈制藥，德國(guó))3 mg bid，連續(xù)使用6 d；采用陰道B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)，若子宮內(nèi)膜厚度<8 mm、A型，戊酸雌二醇用量至4 mg bid，連續(xù)使用5～6 d。子宮內(nèi)膜厚度增長(zhǎng)至≥8 mm，檢測(cè)血清雌二醇(E2)>367 pmol/L、孕酮(P)<3.18 nmol/L，同日轉(zhuǎn)化內(nèi)膜(詳見(jiàn)以下轉(zhuǎn)化方案)；若子宮內(nèi)膜厚度仍<8 mm，增加戊酸雌二醇用量至5 mg bid×3 d、6 mg bid×3 d，依次遞增，如服用戊酸雌二醇達(dá)17～21 d，子宮內(nèi)膜厚度仍<8 mm或≥16 mm或檢測(cè)血清E2、P水平未能達(dá)到前述水平即取消周期。

內(nèi)膜準(zhǔn)備方案二：恒量方案?？诜焖岽贫? mg bid，連續(xù)6 d；采用陰道B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)，子宮內(nèi)膜厚度增長(zhǎng)至≥8 mm、A型，繼續(xù)口服戊酸雌二醇3 mg bid，連續(xù)5～6 d。檢測(cè)血清激素水平，E2>367 pmol/L、P<3.18 nmol/L且子宮內(nèi)膜厚度增長(zhǎng)至≥8 mm，同日轉(zhuǎn)化內(nèi)膜；如檢測(cè)血清E2、P水平未能達(dá)到上述水平，子宮內(nèi)膜厚度增長(zhǎng)至≥8 mm，繼續(xù)口服戊酸雌二醇3 mg bid×3 d，每3 d檢測(cè)血清E2、P水平，達(dá)到上述水平且子宮內(nèi)膜厚度增長(zhǎng)至≥8 mm即轉(zhuǎn)化內(nèi)膜；如服用戊酸雌二醇達(dá)17～21 d，檢測(cè)血清E2、P水平未能達(dá)到上述水平或子宮內(nèi)膜厚度<8 mm或≥16 mm即取消周期。

轉(zhuǎn)化內(nèi)膜方案：方案一(遞增方案)：轉(zhuǎn)化內(nèi)膜第1天黃體酮(天津金耀)20 mg im qd，第2天黃體酮40 mg im qd，第3天黃體酮60 mg im qd，第4天開(kāi)始黃體酮80 mg im qd×14 d直到驗(yàn)孕日；戊酸雌二醇原量服用至驗(yàn)孕日。方案二(恒量方案)：轉(zhuǎn)化內(nèi)膜第1天始黃體酮80 mg im qd×17 d直到驗(yàn)孕日；戊酸雌二醇原量服用至驗(yàn)孕日。

2.胚胎冷凍及解凍：入組患者的卵裂期胚胎或囊胚均進(jìn)行玻璃化冷凍及解凍，玻璃化冷凍及解凍操作與規(guī)程參照我中心的SOP手冊(cè)。胚胎解凍后培養(yǎng)至當(dāng)天下午，解凍后評(píng)分胚胎達(dá)Ⅰ～Ⅱ級(jí)者進(jìn)行移植并入組；評(píng)分不達(dá)標(biāo)者剔除出組。

3.胚胎移植：卵裂期胚胎于轉(zhuǎn)化內(nèi)膜的第4天上午解凍，下午移植；囊胚于轉(zhuǎn)化內(nèi)膜的第6天上午解凍，下午移植。移植胚胎數(shù)分4種情況：卵裂期胚胎1個(gè)或2個(gè)；囊胚1個(gè)或2個(gè)?；颊呷“螂捉厥?，生理鹽水抹洗外陰、陰道及宮頸，在B超監(jiān)測(cè)下，將胚胎移植管的末端輕緩插至距宮底1～1.5 cm左右的位置，緩慢注入胚胎，稍等片刻后，緩慢拔出胚胎移植管，患者平臥0.5～1 h。

4.妊娠判定：胚胎移植后2周行血清HCG檢測(cè)，>5 U/L者為HCG陽(yáng)性。胚胎移植后4～5周B超檢查胚胎發(fā)育情況及妊娠胎數(shù)，凡宮腔內(nèi)有妊娠囊或流產(chǎn)、異位妊娠、多部位同時(shí)妊娠，經(jīng)病理檢查證實(shí)有絨毛者，均為臨床妊娠。

三、觀察分析指標(biāo)

觀察分析指標(biāo)：年齡，人工周期子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備啟動(dòng)日的子宮內(nèi)膜厚度，戊酸雌二醇的服用方案，戊酸雌二醇服用天數(shù)，轉(zhuǎn)化日血清E2、P水平，轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度，轉(zhuǎn)化內(nèi)膜黃體酮的使用方案；移植胚胎類型及胚胎數(shù)，妊娠結(jié)局。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料

本研究共納入768個(gè)FET周期，其中妊娠組476周期，非妊娠組292周期。妊娠組平均年齡較非妊娠組小約3歲，有顯著性差異(P<0.05)；而兩組間不孕年限、不孕因素、竇卵泡數(shù)(AFC)、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)激素水平(FSH、 LH、E2)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者基礎(chǔ)資料[(-±s)，n(%)]

二、FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案及胚胎移植相關(guān)參數(shù)比較

不同年齡、準(zhǔn)備內(nèi)膜啟動(dòng)日的不同子宮內(nèi)膜厚度、戊酸雌二醇服用時(shí)長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度和移植胚胎類型/數(shù)量等因素下的妊娠結(jié)局比較，均有顯著性差異(P<0.05)；戊酸雌二醇的服用方案、轉(zhuǎn)化日血清雌二醇水平和轉(zhuǎn)化內(nèi)膜黃體酮的使用方案等相關(guān)因素下的妊娠結(jié)局比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案及胚胎移植不同參數(shù)下的妊娠結(jié)局

三、多因素回歸分析

將妊娠結(jié)局比較有顯著性差異的相關(guān)因素進(jìn)行Logistic回歸分析。多因素Logistic回歸分析顯示：年齡、準(zhǔn)備內(nèi)膜啟動(dòng)日的子宮內(nèi)膜厚度、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度和移植胚胎類型/數(shù)量與HRT-FET妊娠結(jié)局相關(guān)(分別為OR=1.660、0.510、1.468、2.891，P<0.05)；戊酸雌二醇服用天數(shù)未能進(jìn)入方程(OR=0.815，P>0.05)，提示與妊娠結(jié)局不相關(guān)(表3)。

表3 HRT-FET妊娠結(jié)局影響因素的多因素Logistic回歸分析

討 論

隨著FET技術(shù)水平進(jìn)步，獲得了與鮮胚移植周期相似甚至更高的成功妊娠率。影響FET妊娠結(jié)局的因素很多，根據(jù)本研究分析結(jié)果，討論如下。

年齡是女性生育能力的一個(gè)重要影響困素。青春期后女性卵子的質(zhì)量及數(shù)量隨著年齡的增長(zhǎng)而下降。在輔助生殖技術(shù)的運(yùn)用中，年齡是決定妊娠結(jié)局的關(guān)鍵，因?yàn)槟挲g與胚胎質(zhì)量成正相關(guān)[2]。有研究顯示，自然周期與HRT周期兩種子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的FET周期中，在相同的年齡段妊娠結(jié)局相似[3]。本研究顯示HRT-FET周期中，妊娠組年齡顯著小于非妊娠組，回歸分析也顯示年齡是妊娠結(jié)局的相關(guān)因素，分析認(rèn)為年齡對(duì)FET妊娠結(jié)局的影響，是因?yàn)槟挲g小者胚胎質(zhì)量更好。有研究分析了相同年齡段的贈(zèng)卵周期，不同年齡段受體的妊娠率無(wú)顯著差異[4]，說(shuō)明年齡對(duì)輔助生殖技術(shù)成功臨床妊娠的影響，依然是通過(guò)胚胎質(zhì)量決定，與內(nèi)膜準(zhǔn)備方案相關(guān)不大。

胚胎著床的相關(guān)因素除了胚胎質(zhì)量，還有子宮內(nèi)膜容受性[5]。子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎定位、黏附、著床等的接受能力，子宮內(nèi)膜形態(tài)、厚度、內(nèi)膜下血流、內(nèi)膜上的激素受體因子均影響著子宮內(nèi)膜容受性及胚胎與內(nèi)膜的同步性。目前多數(shù)研究均顯示內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜的厚度與FET的臨床妊娠率相關(guān)，內(nèi)膜的厚度在一定的范圍內(nèi)臨床妊娠率更高。有研究者將FET周期轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜的厚度分為7～12 mm組、>12 mm組及≤7 mm組，通過(guò)比較研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度≤7 mm組的臨床妊娠率最低[6]。宋夢(mèng)玲等[7]研究結(jié)果亦顯示FET周期轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度≥8 mm患者的臨床妊娠率顯著高于轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度<8 mm者。本研究也提示FET周期中轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度在8～14 mm范圍內(nèi)臨床妊娠率高，回歸分析也進(jìn)入方程，提示與HRT-FET周期妊娠結(jié)局相關(guān)。在臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)有部分薄型子宮內(nèi)膜(<6 mm)患者依然可以成功妊娠(限于操作標(biāo)準(zhǔn)，本研究中未顯示相關(guān)結(jié)果)，提示影響胚胎著床的因素還可能有子宮內(nèi)膜血流情況與容積及內(nèi)膜上的激素受體、細(xì)胞因子等，這需要進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)在準(zhǔn)備內(nèi)膜啟動(dòng)日，即月經(jīng)周期3～7 d時(shí)內(nèi)膜的厚度越小，臨床妊娠率反而越高，回歸分析也顯示準(zhǔn)備內(nèi)膜啟動(dòng)日內(nèi)膜厚度是影響HRT-FET周期妊娠結(jié)局的相關(guān)因素。檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。月經(jīng)周期是卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、排卵、撤退出血，周而復(fù)始。卵巢功能好者黃體功能正常，撤退出血內(nèi)膜剝離干凈，新生內(nèi)膜血運(yùn)豐富，生長(zhǎng)達(dá)到移植時(shí)間窗時(shí)間較長(zhǎng)，內(nèi)膜上促進(jìn)胚胎著床的各種細(xì)胞因子旺盛，從而有利于胚胎著床；而準(zhǔn)備內(nèi)膜啟動(dòng)日內(nèi)膜的厚度大的患者可能是相反的情況。后續(xù)需要更多的相關(guān)研究對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證。

對(duì)于HRT準(zhǔn)備內(nèi)膜中雌激素作用時(shí)長(zhǎng)是否與妊娠結(jié)局相關(guān)，各研究結(jié)果不一。閆婭妮等[8]分析了126個(gè)HRT方案準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜的FET周期的臨床資料，按轉(zhuǎn)化內(nèi)膜日雌激素應(yīng)用天數(shù)分為4組：≤21 d、22～28 d、29～35 d、36～48 d，4組間比較臨床妊娠率、早期妊娠丟失率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；張軍等[9]將凍融胚胎移植日的周期時(shí)間分為3組，再將每組細(xì)分為自然周期組和HRT周期組，探討FET周期中胚胎移植時(shí)間對(duì)臨床妊娠率的影響，得出結(jié)論認(rèn)為HRT周期組在月經(jīng)周期第15天后移植有利于獲得更高的臨床妊娠率。本研究將戊酸雌二醇服用不同時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行分組比較，10～15 d時(shí)長(zhǎng)妊娠率較高，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但回歸分析未能進(jìn)入方程。分析認(rèn)為HRT周期準(zhǔn)備內(nèi)膜時(shí)服用戊酸雌二醇一般從月經(jīng)周期第3～7天開(kāi)始，服用10～15 d相當(dāng)于自然周期的第14～22天，接近自然月經(jīng)周期的窗口期，有利于胚胎著床。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論不一致，或許與樣本量較少有關(guān)。

移植胚胎質(zhì)量/數(shù)量是公認(rèn)影響輔助生殖技術(shù)的重要因素。本研究顯示移植D3卵裂胚和D5囊胚的單胚胎移植和雙胚胎移植組間妊娠結(jié)局比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，回歸分析也顯示與妊娠結(jié)局相關(guān)，移植D5囊胚比D3卵裂胚妊娠率高，且無(wú)論D3或D5胚胎移植2個(gè)均比1個(gè)胚胎妊娠率明顯增高。研究表明桑椹胚比卵裂期胚胎整倍體率高50%左右，卵裂期胚胎有高達(dá)60%的非整倍體率[10]。由于不同發(fā)育時(shí)期胚胎的整倍體率不一樣，而且相較于D3卵裂期胚胎，D5囊胚移植暴露于子宮環(huán)境的時(shí)間與自然生理狀態(tài)更接近[11]，同時(shí)只有那些發(fā)育潛能更好的卵裂期胚胎經(jīng)過(guò)繼續(xù)培養(yǎng)才能發(fā)育成囊胚，經(jīng)歷了激活胚胎基因組、融合細(xì)胞、形成以及擴(kuò)大囊胚腔的過(guò)程，因此囊胚發(fā)育潛能更好[12]，故囊胚期胚胎移植的妊娠率高于卵裂期胚胎。

從“胚胎-子宮內(nèi)膜對(duì)話”理論[13]觀點(diǎn)出發(fā)，Matorra等[14]從大數(shù)據(jù)分析認(rèn)為，多個(gè)胚胎的移植促進(jìn)協(xié)同產(chǎn)生更多孕酮及激發(fā)內(nèi)膜表達(dá)有利于著床的因子，改善胚胎與內(nèi)膜的同步性，從而促進(jìn)新的單胚胎的種植，其研究結(jié)果認(rèn)為移植胚胎數(shù)目每增加1個(gè)，新引入的胚胎的種植成功率便會(huì)增加22%。王麗娜等[15]用Logistic回歸分析2 433例胚胎解凍移植預(yù)后因素，認(rèn)為移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及患者年齡是影響FET結(jié)局的主要因素，而移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)對(duì)FET結(jié)局影響最大，移植2個(gè)或以上胚胎臨床妊娠率、胚胎種植率及活產(chǎn)率無(wú)明顯增加，但多胎率明顯升高。

綜上所述，在HRT-FET周期中，影響妊娠結(jié)局的主要因素包括年齡、內(nèi)膜準(zhǔn)備啟動(dòng)日子宮內(nèi)膜厚度、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度以及移植胚胎類型/數(shù)量；在進(jìn)行HRT-FET周期的內(nèi)膜準(zhǔn)備過(guò)程中，應(yīng)綜合考慮影響FET結(jié)局的各種相關(guān)因素，制定個(gè)體化的移植策略，提高妊娠率的同時(shí)，努力降低多胎率，減少母嬰并發(fā)癥。本研究是回顧性分析，受制于樣本數(shù)量和病例選擇，可能存在一定偏倚。更確切的結(jié)論尚需大規(guī)模的前瞻性研究。