倪勝利，何瑞，劉媛，張沛沛，李興茂，楊德龍

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院旱地農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州 730070)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界上主要的糧食作物之一，其產(chǎn)量占世界糧食總產(chǎn)量的30%以上.決定小麥產(chǎn)量的主要因素有單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重，各產(chǎn)量因素之間相互作用，共同決定小麥的產(chǎn)量.在穗數(shù)和穗粒數(shù)一定的條件下，粒重對小麥產(chǎn)量提高具有重要的作用[1-3].因此，研究小麥粒重遺傳特性，對提高小麥粒重遺傳改良效率具有重要的意義.

小麥粒重屬于微效多基因控制的數(shù)量性狀，易受環(huán)境影響[4].據(jù)前人研究，小麥粒重主要受加性效應控制[5-6].王瑞霞等[5]以和尚麥×豫8679為親本的RIL群體為試驗材料，定位了35個與粒重有關的QTL，分布在小麥1A、1B、2A、2D、3A、3B、4A、4D、5A、5B、6D和7D染色體上，可解釋表型變異4.36%～16.80%；周淼平等[6]在多個環(huán)境下對小麥產(chǎn)量性狀進行QTL定位時，檢測到與粒重相關的QTL位點共5個，分別位于2A、2B、3B、4D和7A染色體上，單個QTL可解釋9.6%～25.7%的表型變異；胡亮亮等[7]在多個環(huán)境不同水分條件下定位了19個與粒重相關的QTL位點，分布在除1A、3B、4D和6A以外的其他17條染色體上，并且發(fā)現(xiàn)了在多個環(huán)境下均能夠穩(wěn)定表達的QTL位點以及4個QTL熱點區(qū)域Xmag2064-Xbarc181(1B)、Xwmc522-Xgwn122(2A)、Xwmc446-Xgwm610(4A)和Xwmc603-Xbarc195(7A).以上研究表明，控制小麥粒重的QTL位點在不同群體以及不同環(huán)境中表達數(shù)目和特點各不相同，這對小麥粒重相關QTL的準確定位造成了很大的困難.

元分析(meta-analysis)通過對不同群體和遺傳背景中的QTL位點信息進行整合驗證，確定一致性QTL(MQTL)，進一步細化了QTL位置，減少了實驗間的誤差[8-11].目前，元分析已經(jīng)廣泛應用在作物QTL位點的整合研究中.Chardon等[8]通過對玉米花期相關性狀的QTL位點進行元分析，發(fā)掘出62個MQTL，將玉米花期相關QTL的定位精度提高了兩倍；吳瓊等[9]通過對大豆生育期相關的QTL位點進行元分析，發(fā)現(xiàn)了7個與開花期相關的MQTL和2個與成熟期相關的MQTL；葉亞瓊等[10]通過對311個不同群體中與小麥株高和粒重相關的QTL位點進行元分析，得到28個與株高相關的MQTL和21個與粒重相關的MQTL；Hanocq等[11]使用元分析方法得到2個控制早熟性基因和4個QTL熱點區(qū)域.

本研究以隴鑒19和Q9086為親本雜交創(chuàng)建的重組自交系群體(RIL)進行粒重性狀分析，同時將定位到的QTL同收集到的QTL進行元分析，發(fā)掘“真實”QTL位點，為深入剖析小麥粒重的遺傳基礎和QTL精細定位奠定理論基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以隴鑒19和Q9086為親本雜交創(chuàng)建的RIL群體120個株系為供試材料.隴鑒19是甘肅省農(nóng)業(yè)科學院旱地農(nóng)業(yè)研究所選育的新品種，為甘肅省第一個大面積應用的抗旱北移冬小麥新品種，抗旱性強，耐瘠薄，對水肥反應不敏感.Q9086是西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院小麥研究所提供的品系，對水肥反應敏感，尤其灌漿期對水分反應敏感[12].

1.2 田間試驗與性狀測定

試驗于2014年10月～2015年7月，2016年10月～2017年7月和2017年10月～2018年7月在甘肅省榆中縣小麥試驗點進行，地理坐標N 35°51′，E 104°07′，平均海拔1 900 m，平均氣溫6.6 ℃，年均降水量450 mm，年均蒸發(fā)量1 450 mm，無霜期140 d.3個環(huán)境依次記為E1、E2和E3.在每個環(huán)境中，整個生育期僅播前施基肥1次，基肥量均為純鉀 60 kg/hm2，純氮180 kg/hm2，純磷150 kg/hm2.田間試驗采用隨機區(qū)組設計，設干旱脅迫(drought stress，DS)和正常灌溉(well-watered，WW)兩個水分處理，每個處理3次重復，行長1.0 m，行距0.2 m，每行點播60粒，每株系種植6行.具體水分管理措施為：播種前統(tǒng)一灌溉底墑水(900 m3/hm2)，干旱脅迫處理僅在小麥拔節(jié)期灌水750 m3/hm2，之后完全依靠自然降水；灌溉處理則分別在小麥拔節(jié)期、抽穗期和開花期補充灌水，每次灌水量為750 m3/hm2.其中3個年度環(huán)境下小麥全生育期降水量依次分別為130、142和137 mm.籽粒完全成熟后，按株系分別收獲和風干后，使用小麥籽粒自動考種分析儀(SC-G，杭州萬深)對各株系千粒重(thousand grain weight，TGW)進行測定.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與QTL定位分析

對小麥RIL群體千粒重數(shù)據(jù)采用SPSS V21統(tǒng)計軟件進行分析.廣義遺傳力(h2B)的計算按照Toker[13]提出的方法計算.

結(jié)合前期構(gòu)建的小麥RIL群體分子遺傳連鎖圖譜(共定位了524個SSR標記，形成21個連鎖群，全長22 66.7 cM，兩標記間的平均遺傳距離是4.3 cM)[14-15]進行千粒重QTL定位分析.在QTL IciMapping V 4.0軟件中采用復合區(qū)間作圖法CIM(composite interval mapping)對3個環(huán)境不同處理下的RIL群體千粒重加性QTL(A-QTL)進行檢測及遺傳效應分析.

1.4 QTL數(shù)據(jù)收集與整理

通過Web of Science(http://isiknowledge.com)和中國知識資源公共數(shù)據(jù)庫(http://www.cnki.net)查找并收集國內(nèi)外發(fā)表的關于小麥千粒重相關QTL位點信息[8,16-30,33]，根據(jù)BioMercator 4.2軟件的標準對收集的QTL位點信息進行整理，包括QTL名稱、染色體位置、置信區(qū)間、連鎖系數(shù)、貢獻率、側(cè)翼標記和群體大小等[15].

1.5 QTL信息映射

以高密度遺傳圖譜wheat composite 2004(http//wheat.pw.usda.gov/ggpages/mapse shortlist.html.)為參考圖譜，該圖譜總長度為2 569 cM，共1 235個SSR標記，標記間平均距離為2.2 cM.在BioMercator 4.2軟件中將收集的QTL位點信息數(shù)據(jù)和參考圖譜進行整合，構(gòu)建一致性圖譜.通過高斯定理最大似然比計算一致性QTL可能存在的位置和置信區(qū)間，選取AIC(akaike-type criteria values，AIC)值最小化的模型為最佳模型，即“真實QTL”模型.

2 結(jié)果與分析

2.1 千粒重表型分析

對3個不同水分環(huán)境條件下，小麥RIL群體及其雙親TGW表型分析發(fā)現(xiàn)，正常灌溉條件下TGW的平均值(45.01～46.58 g)顯著高于干旱脅迫條件下的平均值(37.1～42.96 g).但干旱脅迫條件下TGW的變異范圍(21.20～50.28 g)大于正常灌溉(33.33～57.45 g)，且干旱脅迫下TGW表型的變異系數(shù)(7.06%～13.60%)高于正常灌溉(5.95%～8.08%)，說明干旱脅迫是影響小麥TGW的重要環(huán)境因素之一.從群體的分布情況來看，小麥RIL群體的TGW表現(xiàn)出超親分離的現(xiàn)象，群體的分離近似于正態(tài)分布(圖1).

E1～E3分別表示2014～2015、2016～2017和2017～2018年度試驗點，每年度試驗點均設干旱脅迫(DS，條紋柱表示)和正常灌溉(WW，空心柱表示)處理；R、L和Q分別表示RIL群體、隴鑒19和Q9086；Mean、Range、CV(%)、Skew.和Kurt.分別表示RIL群體千粒重表型平均值、變異范圍，變異系數(shù)、偏度和峰度.

從表1中可以看出，TGW的表型變異受到水分環(huán)境(E)、基因型(G)以及基因型與環(huán)境之間互作(G×E)的顯著影響(P≤0.01).其中，水分環(huán)境均方(9 758.30**～15 131.76**)顯著大于基因型均方(27.52**～91.75**)和基因型與環(huán)境互作均方(7.26**～34.15**)，說明水分環(huán)境是影響TGW的主要因素之一.通過對廣義遺傳力(h2B)的分析，在3個環(huán)境中小麥TGW的h2B為0.63～0.74，說明在水分環(huán)境之外，基因型也是控制小麥TGW表型變異的主要因素.

表1 小麥RIL群體千粒重方差分析

2.2 千粒質(zhì)量QTL加性效應分析

從表2中可以看出，利用IciMapping V 4.0軟件采用復合區(qū)間作圖法，在不同處理條件下，共檢測到14個控制TGW的加性QTL位點，分布在1B、3B、4B、4D、5B、6A和6B染色體上(表2).其中Qtgw.cas-1B.1、Qtgw.cas-3B.1、Qtgw.cas-4B.1、Qtgw.cas-4D.1、Qtgw.cas-4D.2、Qtgw.cas-5B.1和Qtgw.cas-6A 7個QTL位點具有降低TGW的效應，其加性效應(A)在0.62～1.32 g，貢獻率(R2)在5.06%～12.15%；Qtgw.cas-3B.3和Qtgw.cas-6B兩個QTL位點具有提高TGW的效應，A在1.01～1.04 g，R2在6.03%～6.46%.同時，在1B、3B、4B和5B上發(fā)現(xiàn)了5個在2個以上環(huán)境中均穩(wěn)定表達的QTL位點，Qtgw.cas-1B.2(E1～E3)、Qtgw.cas-1B.3(E1，E3)、Qtgw.cas-3B.2(E2，E3)、Qtgw.cas-4B.2(E1～E3)和Qtgw.cas-5B.2(E1，E3)，這些位點在不同的環(huán)境中均能夠表達，但其對表型的作用方式在不同環(huán)境以及不同水分處理中有明顯差異，說明這些位點對環(huán)境有著較強的適應性.

表2 不同水分環(huán)境條件下小麥RIL群體千粒重QTL加性效應及其對表型變異的貢獻率

同時，小麥RIL群體在不同環(huán)境及不同處理下控制TGW的位點在不同染色體和同一染色體的不同區(qū)段上都呈不均勻分布(圖2)，在1B、3B和4B染色體上分布最多，達到5～7個，而在其余染色體上分布相對較少.這些QTL位點在對應的染色體上聚集分布，形成QTL熱點區(qū)域，如1B染色體上Xwmc156-Xwmc582，3B染色體上Xbarc68-Xgwm285，4B染色體上Xmag983-Xgwm513.說明在這些染色體區(qū)段上可能存在控制TGW的重要基因.

三角形、圓圈和正方形分別表示2014～2015、2016～2017和2017～2018年甘肅省榆中縣(N 35°51′，E 104°07′)試驗點所檢測到的控制小麥千粒重的QTL；空心圖形表示正常灌溉條件下檢測到的QTL，實心圖形表示干旱脅迫條件下檢測到的QTL.

2.3 QTL元分析

對來自14篇文獻共13個不同作圖群體及定位得到的155個粒重QTL(表3)，通過元分析共得到38個一致性QTL(表4)，主要分布在1B、2B、2D、3A、3B、3D、4A、4D、5B、6A、6B和7A染色體上，平均每條染色體上有3.1個MQTL.在這些MQTL中，有10個MQTL位點的置信區(qū)間小于4 cM，即MQTL2(0.95 cM)、MQTL3(0.46 cM)、MQTL15(2.04 cM)、MQTL17(3.08 cM)、MQTL27(2.2 cM)、MQTL30(1.7 cM)、MQTL31(0.95 cM)、MQTL33(1.45 cM)、MQTL37(3.51 cM)和MQTL38(1.94 cM).有3個MQTL的圖距小于4 cM，即MQTL2(3.54 cM)、MQTL4(3.98 cM)、MQTL19(2.94 cM)，同時發(fā)現(xiàn)MQTL30和MQTL31位于6A染色體相鄰位置且圖距均為7.00 cM，MQTL37和MQTL38位于7A染色體的相鄰位置且圖距均為6.67 cM.從圖3中可以看出，MQTL在染色體上不均勻分布，在1B、2B和5B染色體上分布較為集中，可能在這些區(qū)段中包含有控制TGW的基因.

每條染色體左側(cè)的橫線代表QTL的LOD值；豎線代表QTL的置信區(qū)間.

表3 小麥千粒重QTL數(shù)據(jù)的整合

3 討論

粒重是小麥產(chǎn)量構(gòu)成的重要因素之一，是多基因控制的復雜數(shù)量性狀，易受環(huán)境的影響[19].研究發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫條件下，小麥的粒重隨著干旱程度的增加而下降，同時其表型變異增大，遺傳力下降，說明水分環(huán)境對小麥粒重有顯著作用[29].本研究發(fā)現(xiàn)，與正常灌溉條件相比，干旱脅迫條件下小麥TGW平均下降了6.46 g，變異系數(shù)增加了3.59%.TGW表型變化趨勢與前人研究結(jié)果相同，再次證明了干旱脅迫是小麥粒重的重要影響因素.前人研究表明，控制小麥TGW的QTL位點在小麥21條染色體上均有分布，但是在不同遺傳背景不同環(huán)境中穩(wěn)定表達的QTL位點的數(shù)目和效應不同[5-7,15-28].李美霞等[26]在波蘭小麥1B、2A染色體上檢測到了1個和2個與小麥粒重相關的QTL位點；周淼平等[6]在2A、2B、3B、4D和7A染色體上檢測到5個控制TGW的QTL位點.本研究在1B、3B、4B、4D、5B、6A和6B染色體上共檢測到14個與粒重相關的加位性QTL位點，其中Qtgw.cas-1B.2和Qtgw.cas-4B.2在多個環(huán)境中均能穩(wěn)定表達.同時Qtgw.cas-1B.2在3個環(huán)境中干旱脅迫條件下穩(wěn)定表達，并對TGW表型起負調(diào)控作用.在1B染色體上定位了很多與粒重相關的QTL位點，但是本研究中定位到的QTL位點與其他研究中的位點并未重合，屬于新定位的QTL位點，還有待進一步研究.

同時，元分析通過將來自不同環(huán)境和作圖群體中的QTL位點進行整合和優(yōu)化，篩選出“一致性”QTL，為后續(xù)的精細定位和圖位克隆奠定基礎.近年來，元分析在玉米、大豆等作物改良中發(fā)揮了重要作用.江培順等[30]利用元分析對玉米穗行數(shù)、行粒數(shù)和粒重相關的584個QTL位點進行整合，得到了22個穗行數(shù)MQTL、7個行粒數(shù)MQTL和 44個粒重MQTL，并進一步發(fā)掘得到了10個與玉米產(chǎn)量相關的基因以及12個與水稻產(chǎn)量相關基因具有同源性的候選基因；李長育等[31]對47個與大豆結(jié)瘤性狀相關的QTL進行元分析得到2個MQTL，并通過基因注釋得到8個與大豆結(jié)瘤相關的基因；Tyagi等[32]對80個與小麥籽粒性狀相關的QTL位點進行元分析，在1B、2A、2D、3B、4A、5A、6A和6B染色體上確定了23個相關MQTL，并鑒定出3個與小麥粒重相關的重要MQTL.本研究收集整合了155個與粒重相關的QTL位點，通過元分析共得到38個一致性QTL，置信區(qū)間小于4 cM的MQTL有 10個，置信區(qū)間最小為0.46 cM，圖距小于4 cM的MQTL有 3個，圖距最小為2.94 cM.進一步說明元分析可以縮小QTL位點的置信區(qū)間，從而精確QTL的位置，提高作物分子育種和遺傳改良的效率.

4 結(jié)論

通過QTL的定位分析，在不同的環(huán)境條件下共檢測到14個控制千粒重的QTL位點，分布在1B、3B、4B、4D、5B、6A和6B染色體上，并在1B、3B、4B和5B染色體上發(fā)現(xiàn)了5個在2個以上環(huán)境中均穩(wěn)定表達的QTL位點.通過對13個不同作圖群體155個QTL位點進行元分析，共得到了38個MQTL，將置信區(qū)間縮小到0.46 cM，圖距縮小到2.94 cM，進一步提高了QTL定位精度.同時，本研究發(fā)現(xiàn)在7A染色體Xfba204-Xfbb18b區(qū)段中存在兩個緊密連鎖的MQTL，說明在這個標記區(qū)間中可能存在控制TGW的“真實”QTL，尚需進一步研究證實.本研究通過對千粒重QTL位點進行定位以及在不同作圖群體中進行元分析，確定了穩(wěn)定表達的QTL及其QTL富集區(qū)域，縮小了置信區(qū)間，將為小麥粒重的QTL精細定位和分子標記輔助選擇提供理論依據(jù).