戢爽，陳志，喬楓，楊愛芳，梁向平，謝惠春

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008)

低氧作為一種應(yīng)激因素，幾乎影響機(jī)體所有的功能活動(dòng).在機(jī)體所有組織中，神經(jīng)系統(tǒng)特別是大腦皮層，因沒有氧儲(chǔ)備而只能依賴于恒定、充足的氧供應(yīng)，對低氧最為敏感，是機(jī)體各系統(tǒng)低氧反應(yīng)的主導(dǎo)者.低氧環(huán)境下，動(dòng)脈血氧分壓低成為有效擴(kuò)張腦血管和增加腦血流的重要調(diào)節(jié)因素.機(jī)體通過降低代謝即增加腦血流量等機(jī)制來代償動(dòng)脈血氧的減少.低氧可導(dǎo)致適度的血管收縮和血壓升高，這些反應(yīng)是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)產(chǎn)生[1].位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的延髓控制著呼吸、心率、血壓等內(nèi)臟活動(dòng)，耗氧量高且無氧儲(chǔ)，對低氧極為敏感[2]，其可通過自身系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來應(yīng)對低氧協(xié)迫[3].這一過程可通過神經(jīng)元活動(dòng)標(biāo)志物即刻早期基因c-Fos[4]和參與眾多氧平衡調(diào)節(jié)的低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)[5]等在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)來反映.

c-Fos原癌基因?qū)偌丛缁?，正常生理狀態(tài)在成年動(dòng)物腦干極少表達(dá)或不表達(dá)，但各種中樞損害性刺激均可誘導(dǎo)其快速表達(dá).因此，c-Fos表達(dá)可作為神經(jīng)元是否參與刺激或傷害性信號(hào)傳導(dǎo)的標(biāo)志[6]，可以定性分析神經(jīng)元活動(dòng)狀態(tài)和顯示腦活動(dòng)部位與神經(jīng)通路，c-Fos分布可顯示參與某一神經(jīng)活動(dòng)的神經(jīng)元.c-Fos作為神經(jīng)元活動(dòng)標(biāo)志物，可以表達(dá)把外界信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的刺激信號(hào)，對外界刺激做出應(yīng)答，從而將細(xì)胞外短暫的刺激信號(hào)轉(zhuǎn)換成長時(shí)程的細(xì)胞功能改變[6].

HIF-1是哺乳類O2動(dòng)態(tài)平衡的主要調(diào)控因子[7-8]，由HIF-1α和HIF-1β亞單位組成[7].HIF-1α是低氧誘導(dǎo)亞單位，其活性調(diào)控水平在轉(zhuǎn)錄[9]和轉(zhuǎn)錄后階段[10].HIF-1α參與與有機(jī)體眾多氧平衡調(diào)節(jié)有關(guān)的生理過程，與低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異應(yīng)答密切相關(guān)，被認(rèn)為是細(xì)胞間歇性慢性低氧反應(yīng)所必需的核信號(hào)，在低氧誘導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用.低氧刺激下，HIF-1α降解受阻使HIF-1表達(dá)增加，進(jìn)而激活其對下游靶基因，啟動(dòng)了機(jī)體對缺氧的一系列適應(yīng)機(jī)制，包括：促進(jìn)組織缺氧后微循環(huán)的重建[11-15]；改善組織缺氧后能量代謝障礙[16-22]；作用于EPO而發(fā)揮組織保護(hù)作用[23-28]；參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控[29-32]等.

地下嚙齒類，終生營地下洞穴生活，只能被動(dòng)適應(yīng)低氧濃度環(huán)境，在雨水多的季節(jié)，洞穴氧濃度甚至?xí)?，其對低氧的適應(yīng)除了降低代謝效率，減少骨骼肌收縮等應(yīng)對策略[33]，更重要的是通過對細(xì)胞代謝及許多抗低氧因子誘導(dǎo)從分子水平上來適應(yīng)低氧環(huán)境.甘肅鼢鼠(Myspalaxcansus)隸屬嚙齒目(Rodentia)，鼢鼠亞科(Myospalacinae)，鼢鼠屬(Myspalax)[34]，是我國黃土高原特有地下鼠，終生營地下洞穴生活.作為地下嚙齒類代表性動(dòng)物，甘肅鼢鼠能在各個(gè)層次上顯示出良好的低氧適應(yīng)機(jī)制，低氧能夠誘導(dǎo)一系列特異性的與血管生成、能量代謝及腫瘤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)的基因，幫助自身調(diào)節(jié)和適應(yīng)低氧環(huán)境.

本研究以甘肅鼢鼠(Myspalaxcansus)和SD大鼠(Sprague-Dawwley)為試驗(yàn)對象，分別對甘肅鼢鼠、SD大鼠進(jìn)行急性低氧應(yīng)激4 h、間歇性慢性低氧15 d處理，分析比較兩種動(dòng)物延髓孤束核(NTS)、灰質(zhì)(GC)及藍(lán)斑核(LC)中c-Fos和HIF-1α的表達(dá)，同時(shí)分析了甘肅鼢鼠雌、雄對急性低氧和間歇性慢性低氧的差異性表現(xiàn)，以期為研究地下嚙齒類動(dòng)物低氧適應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料，也為未來低氧適應(yīng)性藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用甘肅鼢鼠于2019年5月捕自陜西省延安市，其中雌雄鼠各12只，體質(zhì)量200～240 g，飼以胡蘿卜.SD大鼠購于陜西省中醫(yī)研究所，同樣雌雄鼠各12只，體質(zhì)量200～240 g，飼以鼠糧.兩種動(dòng)物均置于動(dòng)物飼養(yǎng)箱內(nèi)，以鋸末作籠墊，棉花作巢材，室溫(21±1)℃，光周期14L∶10D條件下飼養(yǎng)，適應(yīng)3周后開始試驗(yàn).

1.2 低氧模型制備與取材

1.2.1 低氧模型制備 將甘肅鼢鼠和SD大白鼠分別隨機(jī)分為3組，每組雌雄各半.常氧對照組在正常氧濃度下進(jìn)行培養(yǎng)；急性低氧組在氧濃度為6.5%的低氧艙內(nèi)短暫培養(yǎng)4 h；間歇性慢性低氧組首先在氧濃度為14.1%的低氧艙內(nèi)培養(yǎng)6 h，然后將其置于正常氧濃度下繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)處理7 d.7 d后，將艙內(nèi)氧濃度降至10.5%，放置低氧倉內(nèi)培養(yǎng)6 h，再次置于正常氧濃度下繼續(xù)培養(yǎng)，持續(xù)處理7 d.7 d后將艙內(nèi)氧濃度降至6.5%，放置低氧倉內(nèi)培養(yǎng)6 h.結(jié)束后正常氧濃度適應(yīng)1 d后立即處理.

1.2.2 取材 甘肅鼢鼠和SD大鼠低氧應(yīng)激結(jié)束后，乙醚麻醉，開胸，左心室插管，灌注生理鹽水200 mL沖洗血液，沖洗干凈后，灌注4%多聚甲醛-PB200-300 mL預(yù)固定，之后斷頭取腦入4%多聚甲醛-PB 4℃下固定24 h，30%蔗糖-PB溶液過夜沉底.

1.3 免疫組化處理

延髓連續(xù)冠狀冰凍切片(Leica CM1510-1/CM1900)，厚40 μm；SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(c-Fos、HIF-1，Santa cruz，1∶500；二抗、SABC，武漢博士德)，DAB(Sigma)顯色，脫水，透明，封片，10×10倍光鏡下觀察其延髓部位的孤束核、灰質(zhì)、藍(lán)斑核，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞.每核團(tuán)10倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中陽性細(xì)胞數(shù).

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 c-Fos表達(dá)

甘肅鼢鼠與SD大鼠在常氧、急性低氧4 h、間歇性慢性低氧15 d條件下延髓孤束核(NTS)、灰質(zhì)(GC)以及藍(lán)斑核(LC)中c-Fos表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示.甘肅鼢鼠在常氧、急性低氧4 h、間歇性慢性低氧15 d條件下延髓c-Fos表達(dá)情況見圖1～3，c-Fos表達(dá)量比較如圖4所示.常氧條件下，甘肅鼢鼠和SD大鼠延髓三核團(tuán)中c-Fos廣泛表達(dá)，甘肅鼢鼠延髓NTC、LC中c-Fos的表達(dá)分別是SD大鼠的1.51倍、1.41倍，均極顯著高于SD大鼠(P<0.01)，而兩種動(dòng)物GC中c-Fos的表達(dá)并無顯著性差異(P>0.05)；急性低氧4 h條件下，雖較常氧組相比兩種動(dòng)物延髓三核團(tuán)中c-Fos的表達(dá)進(jìn)一步增加，但兩種動(dòng)物c-Fos表達(dá)并無顯著差異(P>0.05)；在間歇性慢性低氧15 d條件下，甘肅鼢鼠延髓三核團(tuán)中c-Fos的表達(dá)分別是SD大鼠的1.47、1.74、1.29倍，均極顯著高于SD大鼠(P<0.01).

圖1 甘肅鼢鼠常氧延髓c-Fos的表達(dá)

圖2 甘肅鼢鼠急性低氧4 h延髓c-Fos的表達(dá)

圖3 甘肅鼢鼠間歇性慢性低氧15d延髓c-Fos的表達(dá)

圖4 SD大白鼠與甘肅鼢鼠c-Fos表達(dá)量的比較

表1 SD大白鼠與甘肅鼢鼠c-Fos表達(dá)量的比較

2.2 HIF-1α表達(dá)

甘肅鼢鼠與SD大鼠在常氧、急性低氧4 h、間歇性慢性低氧15 d處理后延髓孤束核(NTS)、灰質(zhì)(GC)以及藍(lán)斑核(LC)中HIF-1α的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示，HIF-1α表達(dá)量比較如圖5所示.常氧條件下，甘肅鼢鼠延髓三核團(tuán)中HIF-1α的表達(dá)分別是SD大鼠的4.49、3.56、4.66倍；急性低氧4 h條件下，甘肅鼢鼠延髓三核團(tuán)中HIF-1α的表達(dá)分別是SD大鼠的2.64、2.60、2.82倍；間歇性慢性低氧15 d條件下，甘肅鼢鼠延髓三核團(tuán)中HIF-1α的表達(dá)分別是SD大鼠的1.82、1.78、1.63倍.3種條件下，甘肅鼢鼠三核團(tuán)HIF-1α表達(dá)量均極顯著高于SD大鼠(P<0.01).

表2 SD大白鼠與甘肅鼢鼠HIF-1α表達(dá)量的比較

圖5 SD大白鼠與甘肅鼢鼠HIF-1α表達(dá)量的比較

2.3 甘肅鼢鼠雌雄個(gè)體c-Fos表達(dá)

甘肅鼢鼠雌雄個(gè)體在常氧、急性低氧4 h、間歇性慢性低氧15 d處理后延髓孤束核(NTS)、灰質(zhì)(GC)以及藍(lán)斑核(LC)中c-Fos的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示，c-Fos表達(dá)量比較如圖6所示.常氧條件下，雌性甘肅鼢鼠個(gè)體延髓三核團(tuán)c-Fos表達(dá)量為分別為雄性個(gè)體的2.05、1.54、2.01倍，均極顯著高于雄性個(gè)體(P<0.01)；急性低氧4 h條件下，雌性甘肅鼢鼠個(gè)體延髓孤束核(NTS)中Fos的表達(dá)量為雄性個(gè)體的1.16倍，呈顯著性差異(P<0.05)，而兩者在延髓灰質(zhì)(GC)以及藍(lán)斑核(LC)中c-Fos的表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)；間歇性慢性低氧15 d條件下，雌性甘肅鼢鼠個(gè)體三核團(tuán)c-Fos表達(dá)量為雄性的1.23、1.19、1.27倍，均極顯著高于雄性個(gè)體(P<0.01).

表3 甘肅鼢鼠雌雄3種條件下c-Fos表達(dá)量的比較(n=4)

圖6 甘肅鼢鼠雌雄3種條件下c-Fos表達(dá)量的比較

2.4 甘肅鼢鼠雌雄個(gè)體HIF-1α表達(dá)

甘肅鼢鼠雌雄個(gè)體在常氧、急性低氧4 h、間歇性慢性低氧15 d處理后延髓孤束核(NTS)、灰質(zhì)(GC)以及藍(lán)斑核(LC)中HIF-1α的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示，HIF-1α表達(dá)量比較如圖7所示.常氧條件下，雌雄甘肅鼢鼠個(gè)體延髓三核團(tuán)HIF-1α表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)；急性低氧4 h條件下，雌性甘肅鼢鼠個(gè)體延髓孤束核(NTS)中HIF-1α的表達(dá)量為雄性個(gè)體的1.06倍，呈顯著性差異(P<0.05)，而兩者在延髓灰質(zhì)(GC)以及藍(lán)斑核(LC)中HIF-1α的表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)；間歇性慢性低氧15 d條件下，雌性甘肅鼢鼠三核團(tuán)HIF-1α表達(dá)量顯著高于雄性個(gè)體，雌性甘肅鼢鼠個(gè)體延髓孤束核(NTS)、灰質(zhì)(GC)HIF-1α的表達(dá)量分別為雄性的1.03倍，1.06倍，均顯著高于雄性個(gè)體(P<0.05)，雌性甘肅鼢鼠個(gè)體延髓藍(lán)斑核(LC)中HIF-1α的表達(dá)量為雄性個(gè)體的1.19倍，呈極顯著差異(P<0.01).

表4 甘肅鼢鼠雌雄3種條件下HIF-1α表達(dá)量的比較

圖7 甘肅鼢鼠雌雄3種條件下HIF-1α表達(dá)量的比較

3 討論與結(jié)論

持續(xù)低氧刺激，不僅影響動(dòng)物的生長發(fā)育和各種生理活動(dòng)，而且對各種器官組織也會(huì)產(chǎn)生巨大損傷[35]，但在長期的進(jìn)化過程中，世居高原動(dòng)物、水生動(dòng)物[36]以及穴居地下動(dòng)物的器官、組織及細(xì)胞，通過降低代謝效率、減少骨骼肌收縮、調(diào)控血象指標(biāo)等策略，使其在不同程度顯示出較強(qiáng)的低氧適應(yīng)能力.同時(shí)在低氧刺激時(shí)，眾多低氧誘導(dǎo)基因的差異表達(dá)，使得各類低氧適應(yīng)的靶基因從分子水平上進(jìn)行快速響應(yīng)，使機(jī)體能夠迅速做出低氧適應(yīng)性反應(yīng).延髓被認(rèn)為是神經(jīng)動(dòng)物的生命中樞，直接調(diào)控動(dòng)物的心血管和呼吸運(yùn)動(dòng)功能，在動(dòng)物低氧刺激早期發(fā)揮重要功能.因此，我們結(jié)合急性低氧與間歇性慢性低氧的方法，比較甘肅鼢鼠與SD大鼠c-Fos、HIF-1α在延髓孤束核(NTS)、灰質(zhì)(GC)、藍(lán)斑核(LC)3種核團(tuán)內(nèi)的表達(dá)，從中樞調(diào)控水平討論地下鼠低氧應(yīng)對策略.

3.1 c-Fos表達(dá)結(jié)果

c-Fos基因受到外界刺激后可迅速表達(dá)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過c-Fos基因的表達(dá)把外界信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的刺激信號(hào)，從而對外界的刺激做出應(yīng)答，因此c-Fos的表達(dá)可作為神經(jīng)元是否參與刺激或傷害性信號(hào)傳導(dǎo)的標(biāo)志[6].本試驗(yàn)結(jié)果表明，甘肅鼢鼠在常氧條件下延髓c-Fos廣泛表達(dá)，從急性低氧到間歇性慢性低氧條件下c-Fos表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢.與SD大鼠比較，常氧條件下甘肅鼢鼠和大鼠延髓NTC，LC中c-Fos廣泛表達(dá)，甘肅鼢鼠表達(dá)量極顯著高于大鼠(P<0.01)，這可能是由于甘肅鼢鼠終生營地下生活，其本身神經(jīng)元活性較地上鼠有更強(qiáng)的活性，使其在低氧環(huán)境下的延髓調(diào)控中樞能夠更好地應(yīng)對低氧，同時(shí)除GC外兩種核團(tuán)c-Fos表達(dá)量在兩種動(dòng)物間也存在極顯著性差異，可能因?yàn)楦拭C鼢鼠由于營終生地下生活，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境對其是相對“富氧”環(huán)境，因此在常氧條件下，其呼吸、心血管活動(dòng)的延髓調(diào)控中樞可能會(huì)出現(xiàn)有異于試驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)元反應(yīng).而在GC處無差異則提示呼吸上行通路可能不僅僅嚴(yán)格受控于延髓，可能還直接受中腦或者下丘的調(diào)控.這與11%氧濃度下，對SD大鼠處理3 h(急性低氧)后，c-Fos蛋白在孤束核(NTC)、灰質(zhì)(GC)表達(dá)明顯增多，在藍(lán)斑核(LC)表達(dá)增多不明顯[37]的研究結(jié)果十分相似.急性低氧4 h條件下，雖較常氧組相比兩種動(dòng)物延髓三核團(tuán)中c-Fos的表達(dá)進(jìn)一步增加，但兩種動(dòng)物c-Fos表達(dá)并無顯著差異(P>0.05).急性低氧對于二者均為應(yīng)激刺激，在短時(shí)程內(nèi)甘肅鼢鼠與SD大鼠均可產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，說明二者神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)一致.在間歇性慢性低氧15 d條件下，甘肅鼢鼠延髓三核團(tuán)中Fos的表達(dá)均極顯著高于SD大鼠(P<0.01)，SD大鼠c-Fos表達(dá)雖然繼續(xù)增加，但是幅度不大，可能是間歇性低氧緩解了SD大鼠對低氧環(huán)境的適應(yīng)程度，而甘肅鼢鼠在此階段，延髓神經(jīng)元仍能對環(huán)境做出反應(yīng)，說明甘肅鼢鼠長期的低氧適應(yīng)可增強(qiáng)機(jī)體低氧適應(yīng)機(jī)制[38].

3.2 HIF-1α表達(dá)結(jié)果

HIF-1α廣泛參與哺乳動(dòng)物缺氧誘導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)，是機(jī)體細(xì)胞適應(yīng)低氧的主要中介物質(zhì)，對機(jī)體組織在缺氧條件下維持內(nèi)環(huán)境的平衡起著重要的調(diào)節(jié)作用[39].本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘肅鼢鼠低氧條件下HIF-1α表達(dá)模式與高原鼠兔和鼴形鼠一致[33,40].其延髓束核(NTS)、灰質(zhì)(GC)以及藍(lán)斑核(LC)在常氧條件下就有廣泛的HIF-1α表達(dá)，隨著時(shí)間推移，HIF-1α表達(dá)量進(jìn)一步增加，說明隨著低氧時(shí)程增加，機(jī)體為改善組織缺氧后能量代謝障礙，加快組織缺氧的恢復(fù)過程，HIF-1α表達(dá)增多，激活下游靶基因，啟動(dòng)機(jī)體的缺氧適應(yīng)機(jī)制，促進(jìn)微循環(huán)重建、葡萄糖載體蛋白和醛縮酶乳酸脫氫酶等糖酵解酶表達(dá)增加、紅細(xì)胞生成，提高血液攜氧量等來達(dá)到機(jī)體眾多氧平衡調(diào)節(jié)，說明HIF-1α表達(dá)與低氧或缺氧程度和時(shí)間有明顯的依存關(guān)系.這與以往的研究結(jié)果一致[41].在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在3種不同條件處理下，甘肅鼢鼠NTS、LC、GC HIF-1α表達(dá)均極顯著地高于SD大鼠.參照甘肅鼢鼠與SD大鼠急性低氧4 h后，c-Fos蛋白在延髓各核團(tuán)的表達(dá)無顯著差異，說明在同種條件下兩種鼠感受的低氧刺激是相同的，而甘肅鼢鼠在急性低氧后各核團(tuán)HIF-1α的表達(dá)極顯著高于SD大鼠，說明甘肅鼢鼠對于短時(shí)程的低氧應(yīng)激易于耐受，說明甘肅鼢鼠長期在地下低氧環(huán)境的生活史，使其能對長時(shí)程、低濃度刺激做出更積極的應(yīng)對策略.此外，甘肅鼢鼠HIF-1α在NTS、LC、GC在同一處理?xiàng)l件下的表達(dá)無顯著性差異，這與以往報(bào)道一致[42-44]，甘肅鼢鼠腦部其他區(qū)域HIF-1α的表達(dá)是否具有組織或細(xì)胞特異性還需要進(jìn)一步討論.

3.3 甘肅鼢鼠雌雄個(gè)體c-fos、HIF-1α表達(dá)結(jié)果

機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)是神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多系統(tǒng)的綜合應(yīng)答過程，在引起交感神經(jīng)活性、神經(jīng)內(nèi)分泌功能改變的同時(shí)，也受到中樞系統(tǒng)的高級(jí)整合和中介作用[45]，雌雄個(gè)體對機(jī)體內(nèi)外環(huán)境做出的應(yīng)答反應(yīng)有所差異[46].常氧狀態(tài)下，雌性甘肅鼢鼠c-Fos表達(dá)明顯低于雄性個(gè)體，但HIF-1α差異不明顯，提示雌性個(gè)體對相對“富氧”的環(huán)境因素并不敏感.急性低氧4 h后，雌性個(gè)體延髓孤束核(NTC)c-Fos表達(dá)明顯低于雄性個(gè)體，但HIF-1α的表達(dá)卻顯著偏高；間歇性慢性低氧15 d后，雌性個(gè)體在三核團(tuán)的c-Fos表達(dá)均明顯低于雄性個(gè)體，HIF-1α的表達(dá)卻明顯高出.這些結(jié)果提示雌性甘肅鼢鼠對于急性、間歇性慢性低氧刺激可能較雄性個(gè)體具有更強(qiáng)的耐受性，其具體應(yīng)答策略及在應(yīng)答過程中是否主要依賴HIF-1α誘導(dǎo)的調(diào)控途徑有待于進(jìn)一步研究.