郭俊宏，申曉麗，洪向前，馬大卉，謝洪彬，楊明民，汪建濤

(深圳市眼科醫(yī)院青光眼科，暨南大學(xué)附屬深圳眼科醫(yī)院，深圳眼科學(xué)重點實驗室，廣東 深圳 518040)

青光眼是世界上第2位致盲性眼病。研究[1]表明：在2040年全球青光眼患者將達到1.118億人。開角型青光眼(open angle glaucoma，OAG)作為一種主要的青光眼類型，有部分學(xué)者[2]認為其主要發(fā)病機制是：小梁網(wǎng)細胞(trabecular meshwork cell，TMC)的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)異常沉積，使得房水流出阻力增加，最終引起眼壓升高。而TMC在氧化應(yīng)激的作用下會發(fā)生ECM的異常沉積[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(silent information regulator 1，SIRT1)是一種可以使組蛋白中賴氨酸殘基去乙?；娜ヒ阴；?，其廣泛參與氧化應(yīng)激耐受、胰島素分泌和葡萄糖合成等生理活動。此外，SIRT1還能通過抑制ECM的異常沉積影響纖維化進程，在心肌纖維化[4]、肝纖維化[5]等疾病中起到非常重要的作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理HTMC后，SIRT1的RNA及蛋白表達水平會顯著下降。本研究通過在人小梁網(wǎng)細胞(human trabecular meshwork cell line，HTMC)中過表達SIRT1，探討SIRT1對氧化應(yīng)激下HTMC功能的影響，為SIRT1用于青光眼的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人原代小梁網(wǎng)細胞系購自美國Sc ienCel l公司；細胞培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；SIRT1過表達慢病毒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；TRIzol RNA提取劑購自美國Invitrogen公司；第一鏈cDNA合成試劑盒購自瑞士Roche公司；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)購自美國Thermo公司；30%過氧化氫購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；Cell Counting Kit-8試劑盒購自日本同仁化工；Transwell細胞侵襲遷移培養(yǎng)皿購自美國Corning公司；ROS活性氧檢測試劑盒(DCFHDA法)購自上海貝博生物公司；常溫超速離心機購自德國Eppendorf公司；CO2培養(yǎng)箱為瑞士HEAL FORCE公司HF 160W型；移液槍、PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司；生物安全柜購自北京HDL公司；純水制備儀購自法國Millipore公司；7500 Fast real-time PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 HTMC培養(yǎng)

HTMC在含有10%胎牛血清、丙酮酸鈉(終濃度為1 mmol/L)、L-谷氨酰胺(終濃度為20 mmol/L)、非必需氨基酸(終濃度為100 μmol/L)、青霉素(終濃度為100 units/mL)及鏈霉素溶液(終濃度為100 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HTMC在恒溫37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，當細胞匯合度達70%～80%時進行傳代。

1.2.2 SIRT1過表達慢病毒轉(zhuǎn)染HTMC模型的構(gòu)建

細胞按照5×104/孔種于6孔板中，24 h后棄去培養(yǎng)基；每孔對應(yīng)取一個新的1.5 mL EP管，往里加入完全培養(yǎng)基1 mL以及適量的polybrene(使polybrene的終濃度為5 μg/mL)，再分別加入2 μL、20 μL、200 μL的1×108TU/mL的SIRT1過表達慢病毒，吹打混勻后將混合液加入到每孔中；12 h后棄去培養(yǎng)基，加入新的完全培養(yǎng)基2 mL，以供后續(xù)實驗使用。

1.2.3 細胞遷移實驗

HTMC以1×105/孔預(yù)種于6孔板，24 h后做相應(yīng)處理；而后用杜爾貝科磷酸鹽緩沖液潤洗細胞2遍，棄液，0.25%胰蛋白酶消化，離心，棄上清并用1 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，吸50 μL懸液加10%臺盼藍染色計數(shù)；提前將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，往上室加入100 μL細胞培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2孵箱孵育1 h；吸除小室中的培養(yǎng)基，在下室中加入600 μL完全培養(yǎng)基(血清:DMEM=1:1)，用含有0.2%小牛血清的細胞培養(yǎng)基以5×104/mL HTMC種于上室中，上樣200 μL，37 ℃、5% CO2孵箱繼續(xù)培養(yǎng)10～12 h；吸出小室和24孔板內(nèi)液體，用棉簽將小室上表面的細胞輕輕擦掉；配置結(jié)晶紫工作液(0.03 g結(jié)晶紫粉劑加到6 mL無水乙醇中，再用24 mL生理鹽水稀釋，全程避光)，往小室和24孔板內(nèi)加入800 μL結(jié)晶紫工作液，避光室溫孵育20 min；用磷酸鹽緩沖液洗3遍，每遍10 min；吸除磷酸鹽緩沖液，再將小室倒置晾干，用無菌尖刀片將小室膜切下(注意正反面不要弄錯)，并置于載玻片上；使用中性樹膠封片，滴1滴樹膠于小室表面，再蓋上蓋玻片，注意避免氣泡產(chǎn)生；用倒置顯微鏡觀察，按照象限隨機選擇6～8個視野，并拍照計數(shù)。

1.2.4 CCK8細胞活性檢測

將HTMC懸液按照3×104/mL種于96孔板中，每孔上樣100 μL，37 ℃、5% CO2孵箱預(yù)培養(yǎng)；24 h后根據(jù)實驗需要處理HTMC；刺激結(jié)束后將培養(yǎng)液吸除，并用PBS洗2遍，吸除；按照細胞培養(yǎng)基：CCK8溶液=9:1向每孔加入混合液100 μL(注意避免產(chǎn)生氣泡)，孵箱繼續(xù)孵育1～2 h；最后用酶標儀450 nm測定吸光度(OD值)。細胞活力(%)=[OD(被處理過的細胞)-OD(僅有培養(yǎng)基)]/[OD(僅有細胞和培養(yǎng)基)-OD(僅有培養(yǎng)基)]×100。

1.2.5 實時定量PCR法檢測基因的表達水平

根據(jù)TRIzol試劑的說明書提取HTMC 的總RNA，根據(jù)第一鏈cDNA 合成試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用隨機引物進行擴增。再根據(jù)FastStart Universal SYBR Green Master試劑盒說明書加樣以及目的基因的相應(yīng)引物(表1)，擴增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火并延伸60 s，共40個循環(huán)。其中β-actin作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法計算各組細胞中相關(guān)RNA的相對表達量。其中ΔΔCt=(目的基因CT值-內(nèi)參基因C值)實驗組-(目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值)對照組。

表1 相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primer sequences of related genes

1.2.6 ROS測定

按照1:1000用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFHDA，將各組處理好的細胞收集后重懸于稀釋好的DCFH-DA中，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min(避光)，每隔4 min顛倒混勻一下。隨后用無血清細胞培養(yǎng)基洗滌細胞3次。用96孔板檢測，每組樣品添加4份，使用多功能酶標儀檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，讀取A值，然后以空白對照組為100%，其他各組與之對比，得出的結(jié)果為檢測值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果均由至少3次的獨立實驗統(tǒng)計而得。采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理。本研究中各檢測指標的計量資料經(jīng)Kolmogorov-Smimov檢驗證實呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差()表示。采用完全隨機分組單因素干預(yù)多水平實驗設(shè)計，SIRT1過表達組和GFP病毒空載體組組間RNA相對表達量的總體差異比較均采用獨立樣本t檢驗分析，多樣本組間兩兩比較先進行方差齊性檢驗，方差齊采用LSD-t法，方差不齊采用Dunnett T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功建立SIRT1過表達慢病毒感染HTMC模型

筆者將SIRT1過表達慢病毒和GFP陰性對照慢病毒按照感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為10轉(zhuǎn)染入HTMC，轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下可觀察到HTMC內(nèi)有明顯的報告基因GFP表達，表明SIRT1過表達慢病毒成功轉(zhuǎn)染至HTMC中(圖1)。

圖1 顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染HTMC 48 h后的轉(zhuǎn)染情況(×100)Figure 1 HTMC was observed under the microscope after lentivirus transfection for 48 hours (×100)

2.2 SIRT1 在轉(zhuǎn)染后HTMC 的表達水平明顯提高

分別提取感染了SIRT1過表達慢病毒或GFP陰性對照慢病毒的HTMC的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行Real-time PCR實驗，檢測兩組中SIRT1的表達水平差異，使用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達倍數(shù)變化，結(jié)果顯示：與GFP陰性對照組相比，SIRT1過表達組中SIRT1的表達水平明顯高于對照組(1.000±0.056 vs 0.095±0.005，P＜0.0001)；同樣地，SIRT1過表達組中SIRT1的蛋白表達水平也明顯高于對照組(圖2)。

圖2 SIRT1過表達組與GFP陰性對照組中SIRT1在mRNA水平和蛋白水平的比較Figure 2 Comparison of SIRT1 mRNA and protein levels between SIRT1 overexpression group and GFP negative control group

2.3 SIRT1 過表達能有效降低氧化應(yīng)激對HTMC遷移能力的影響

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示：H2O2刺激組每孔細胞遷移數(shù)量為254±25，正常對照組為436±73，兩者在細胞遷移能力上，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。另外，H2O2+Lv-SIRT1-OE組每孔細胞遷移數(shù)量為510±51，陰性對照組(H2O2+Lv-GFP)為327±46，H2O2+Lv-SIRT1-OE組分別與H2O2組和陰性對照組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，說明SIRT1過表達能有效降低氧化應(yīng)激對HTMC遷移能力的影響(圖3)。

2.4 SIRT1 過表達能有效降低氧化應(yīng)激對HTMC細胞活性的影響

CCK8增殖實驗結(jié)果顯示：H2O2刺激組與正常對照組在細胞活性上，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。同時，H2O2+Lv-SIRT1-OE組分別與H2O2組和陰性對照組(H2O2+Lv-GFP)相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且與正常組的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，表明SIRT1過表達能有效降低氧化應(yīng)激對HTMC細胞活性的影響(圖4)。同時檢測凋亡標志蛋白Bax和Bcl-2，H2O2+Lv-SIRT1-OE組分別與H2O2組和陰性對照組(H2O2+Lv-GFP)相比，Bax表達水平明顯下降，Bcl-2表達水平明顯提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖5)。此外，通過ROS活性氧測定，筆者發(fā)現(xiàn)H2O2+Lv-SIRT1-OE組比H2O2組的細胞活性氧水平顯著地降低(P＜0.05)，表明SIRT1過表達能有效降低氧化應(yīng)激狀態(tài)下HTMC的活性氧水平(表2)。

表2 SIRT1過表達對氧化應(yīng)激下HTMC活性氧水平的影響Table 2 Effects of SIRT1 overexpression on reactive oxygen species of HTMC under oxidative stress

圖4 SIRT1過表達對氧化應(yīng)激下HTMC細胞活性的影響Figure 4 Effect of SIRT1 overexpression on cell viability of HTMC under oxidative stress

圖5 SIRT1過表達對凋亡標志蛋白表達的影響Figure 5 Effect of SIRT1 overexpression on expression of apoptotic marker proteins

3 討論

SIRT1存在于眼部近乎所有組織中，如角膜、睫狀體、葡萄膜、晶狀體、視網(wǎng)膜等[6]。在青光中，HTMC對氧化應(yīng)激的反應(yīng)在房水流出通路的生理過程中起重要作用[7-8]。研究[9]顯示：與正常HTMC相比，SIRT1在青光眼HTMC中的表達量顯著較低，且SIRT1可以使HTMC免受氧化應(yīng)激所致的細胞凋亡和DNA雙鏈損傷。表明SIRT1在一定程度上參與到青光眼的發(fā)病機制當中，并發(fā)揮重要作用。

白藜蘆醇(resveratrol，RSV)作為SIRT1的激動劑，可通過激活SIRT1來保護細胞免受外界刺激的損傷，提高其抗氧化能力[10]。在青光眼方面，RSV可抑制小梁網(wǎng)細胞中活性氧的產(chǎn)生[11]及多種炎癥因子的表達[12]。多數(shù)學(xué)者[2-3]認為：ECM的異常積聚是開角型青光眼的主要發(fā)病機制之一[2]，而氧化應(yīng)激是導(dǎo)致ECM異常沉積的重要機制之一[3]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)：在300 μmol/L H2O2刺激2 h下，經(jīng)過RSV處理的HTMC，其ECM的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平都比只用H2O2處理的HTMC要低[13]；同樣，在300 μmol/L H2O2刺激2 h下，在HTMC中過表達SIRT1，其ECM的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平都比只用H2O2處理的HTMC要低，證明SIRT1也參與到了調(diào)控人小梁網(wǎng)細胞ECM生成的過程中。為探究氧化應(yīng)激對HTMC細胞功能的影響，本研究應(yīng)用了CCK-8及Transwell實驗進行評估，結(jié)果顯示：氧化應(yīng)激會使得HTMC活性降低，同時也會對細胞遷移有抑制作用。而在HTMC中，過表達SIRT1能有效降低氧化應(yīng)激對HTMC活性以及遷移能力的影響。同時，過表達SIRT1能顯著減少細胞內(nèi)Bax表達水平，減少ROS的產(chǎn)生。因此，筆者認為激動氧化應(yīng)激下HTMC中的SIRT1將極有可能會對HTMC產(chǎn)生保護作用。

SIRT1抵抗氧化應(yīng)激可能存在多種調(diào)控機制。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，SIRT1可調(diào)控多種靶蛋白，例如FOXO、p53等。研究[14]表明：高糖誘導(dǎo)人晶狀體上皮細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，F(xiàn)OXO3是應(yīng)激反應(yīng)早期敏感的指標，氧化應(yīng)激狀態(tài)下，SIRT1與FOXO3在細胞中形成復(fù)合物，并去除FOXO3的乙?；?，從而保護細胞避免凋亡，提高對氧化應(yīng)激的抵抗力。另一項研究[15]顯示：p53蛋白穩(wěn)定性增加或者被激活都能誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生，SIRT1能夠降低p53乙酰化水平，從而阻止氧化應(yīng)激與DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡。此外，SIRT1能夠調(diào)高抗氧化酶MnSOD的活性，提高H9C2心肌細胞中氧化物的清除率從而實現(xiàn)抗氧化應(yīng)激的作用[16]。

青光眼濾過手術(shù)(glaucoma filtration surgery，GFS)是一種針對降眼壓藥物和激光治療不理想時的主要手術(shù)方式，而GFS的失敗主要是由于瘢痕形成、ECM增生及纖維化，最終導(dǎo)致濾過泡功能減退[17]。因此，通過激動SIRT1，比如使用SIRT1的激動劑——RSV，這將有可能應(yīng)用于GFS術(shù)后，減少術(shù)后ECM沉積及瘢痕化，從而更好地維持濾過泡的形成。

筆者前期曾采用Agilent長鏈非編碼RNA芯片對分別轉(zhuǎn)染了SIRT1過表達慢病毒和GFP陰性對照慢病毒的HTMC樣本進行長鏈非編碼RNA表達譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路[18-19]、FoxO信號通路[20-21]、MAPK信號通路[22]、mTOR信號通路[23]以及PI3K-Akt信號通路[24-25]均可能參與開角型青光眼的發(fā)病過程，而這些信號通路與細胞外基質(zhì)的異常沉淀、氧化應(yīng)激和細胞凋亡密切相關(guān)。筆者認為SIRT1將在其中扮演重要角色。但是本研究還有不足之處，本研究僅在體外完成，還需要更多的體內(nèi)實驗來驗證結(jié)論的準確性。此外，本研究只進行了RNA分析，后續(xù)研究中還需要進行具體的蛋白表達分析。關(guān)于SIRT1過表達能夠降低氧化應(yīng)激對HTMC遷移能力的影響，筆者考慮是否可能是通過促進HTMC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)完成的，還需要補充EMT相關(guān)分子的表達水平變化。

綜上，在HTMC中過表達SIRT1能有效降低氧化應(yīng)激對HTMC活性以及遷移能力的影響，對病理狀態(tài)下的HTMC起到保護作用。通過結(jié)合前期高通量基因芯片的結(jié)果，筆者將篩選出差異表達的長鏈非編碼RNA，并結(jié)合上述所提及的通路，進一步探究SIRT1保護氧化應(yīng)激狀態(tài)下HTMC功能的具體調(diào)控機制，為青光眼臨床治療提供真實有效的科學(xué)依據(jù)。