農(nóng)進(jìn)，梁瓊，廖林，李軍，韋凌云，陸江玉，陳紅，廖品琥

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；2. 廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530004；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院重癥醫(yī)學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratorty distress syndrome，ARDS)是ICU病房中常見的一種嚴(yán)重綜合征，隨著俯臥位通氣、體外膜肺氧合(ECMO)等高精技術(shù)的臨床使用，其死亡率有所降低，但仍高達(dá)40%左右[1]。有研究顯示過度的炎癥反應(yīng)失控是ARDS肺損傷的主要原因，然而使用炎癥因子拮抗劑并不能有效降低病死率[2]。自噬性細(xì)胞死亡(autopohagic cell death，ACD)是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡形式，有望成為ARDS新的治療靶點。

高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是一種重要的細(xì)胞外晚期炎癥介質(zhì)，在細(xì)菌感染、敗血癥及其它刺激誘導(dǎo)的ARDS體內(nèi)外模型中，HMGB1可在細(xì)胞內(nèi)、核內(nèi)或細(xì)胞外水平調(diào)節(jié)自噬。HMGB1與自噬相互作用在不同細(xì)胞類型中有著不一樣的機(jī)制，且依賴觸發(fā)損傷的性質(zhì)[3]。內(nèi)毒素是感染的重要原因之一，其主要成分為脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，本實驗使用LPS刺激A549細(xì)胞，探討HMGB1對肺泡上皮細(xì)胞的自噬是否具有調(diào)控作用，為制定新的治療策略打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 A549 細(xì)胞購于中國科學(xué)院干細(xì)胞庫；LC3a/b、HMGB1、β-actin購于Affinity；CCK-8試劑購于Fluorescence；轉(zhuǎn)染試劑LP-2000購于invitrogen公司；凋亡檢測試劑盒購于Solarbio；電鏡固定液：索萊寶；無水乙醇、丙酮購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；812包埋劑購于SPI；凋亡檢測試劑盒購于Solarbio公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代 從-80℃冰箱中快速取出細(xì)胞凍存管，立即放入37℃溫水中融解；A549細(xì)胞復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)、換液，當(dāng)細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶約80%面積時，對細(xì)胞消化、傳代后用于后續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8 檢測LPS對A549細(xì)胞存活率的影響 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中。濃度為1×104個/毫升，加入不同濃度藥物，同時設(shè)置空白組、正常對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入CCK-8溶液后，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h；測450 nm處的吸光度。

1.2.3 藥物處理分組 (1)A549細(xì)胞融合度達(dá)80%時，分別用不同濃度的LPS作用于A549細(xì)胞24 h，100 μg/ml處理不同時間；(2)隨機(jī)將細(xì)胞分為：①空白組；②LPS組；③Si-HMGB1組；④Si-HMGB1+LPS組。Si-HMGB1處理組中先siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，加入100 μg/ml LPS 24 h。

1.2.4 細(xì)胞凋亡的檢測 A549細(xì)胞培養(yǎng)、消化后，分為空白組和LPS組。嚴(yán)格按照流式細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 透射電鏡法檢測自噬超微結(jié)構(gòu) 取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，加入100 μg/ml的 LPS，培養(yǎng)24 h后，隨后取材、固定、脫水、滲透、包埋、切片、染色等步驟處理后透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞的總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。每組取等量蛋白行10%SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)移凝膠至PVDF膜，室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗37℃孵育90 min，洗膜，ECL發(fā)光顯影。通過Image J軟件對蛋白印跡條帶灰度值進(jìn)行半定量分析，采用目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來獲得目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 LPS對A549細(xì)胞存活率的影響 使用不同濃度的LPS作用于A549細(xì)胞24 h后，CCK-8 法檢測結(jié)果見圖1顯示，劑量<100 μg/ml的LPS處理后，細(xì)胞活性無明顯改變，與正常對照組(0 μg/ml)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，劑量達(dá)到100 μg/ml之后細(xì)胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，取此劑量用于后續(xù)ARDS肺泡上皮細(xì)胞損傷的細(xì)胞造模劑量。

注：與空白對照組(0 μg/ml)相比，*P<0.01。圖1 CCK8檢測不同劑量的LPS對A549細(xì)胞活力的影響

2.2 最低細(xì)胞毒劑量的LPS對A549細(xì)胞損傷不依賴凋亡和壞死 為了進(jìn)一步驗證細(xì)胞存活率的下降是否依賴于凋亡和壞死，采用Annexin V-FITC 和PI雙染法，檢測100 μg/ml的LPS作用于A549細(xì)胞24 h的細(xì)胞凋亡和壞死情況。由圖2散點圖可見，LPS 處理組的B1、B2、B4與對照組比較，細(xì)胞數(shù)無明顯增加，細(xì)胞凋亡率、壞死與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?？梢?，濃度為100 μg/ml的LPS作用A549細(xì)胞之后，細(xì)胞存活率下降不依賴于凋亡和壞死。

注：上圖為空白組和LPS組的散點圖，下圖為兩組細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計分析結(jié)果。圖2 流式細(xì)胞技術(shù)檢測LPS對A549細(xì)胞凋亡影響

2.3 LPS誘導(dǎo)后A549細(xì)胞透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 透射電鏡觀察如圖3所見：正常對照組中：未見典型結(jié)構(gòu)自噬小體，自噬溶酶體(ASS)少量存在。LPS組中：線粒體數(shù)量較少，胞質(zhì)中大量的自噬小體(AP)和自噬溶酶體，未見調(diào)亡小體形成，核膜完整。結(jié)果提示LPS 能引起 A549細(xì)胞自噬，結(jié)合上述流式細(xì)胞檢測結(jié)果及自噬性細(xì)胞死亡的特征，LPS引起的細(xì)胞存活率下降為自噬性細(xì)胞死亡。

圖3 LPS誘導(dǎo)后 A549細(xì)胞的透射電鏡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

2.4 RNA干擾A549細(xì)胞HMGB1后各組蛋白表達(dá)比較 為了驗證HMGB1是否可以介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞自噬及自噬性細(xì)胞死亡，我們使用最低毒性劑量的LPS(100 μg/ml)刺激A549細(xì)胞24 h，聯(lián)合使用siRNA 干擾HMGB1 的表達(dá)干預(yù)A549細(xì)胞，Western blot實驗檢測自噬相關(guān)蛋白。結(jié)果如圖4所見：正常組的A549細(xì)胞僅有微量的HMGB1和自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達(dá)，LPS誘導(dǎo)后明顯增加A549細(xì)胞HMGB1和LC3B-Ⅱ的蛋白表達(dá)量。Si-HMGB1干預(yù)后，LC3B-Ⅱ/LCB3-1和HMGB1的蛋白表達(dá)量介于LPS組和空白組，與LPS組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Si-HMGB1能抑制LPS 誘導(dǎo)A549細(xì)胞LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的表達(dá)。

注：與空白組比，#P<0.01；與LPS組相比，★P<0.01；與LPS組相比，*P<0.05。圖4 Si-HMGB1對A549細(xì)胞HMGB1和自噬蛋白表達(dá)的影響

3 討論

ARDS 的病因復(fù)雜，有肺內(nèi)因素的直接作用和肺外因素間接作用，其中膿毒癥或膿毒性休克是 ARDS 發(fā)病的主要原因，也是急危重癥病房死亡率很高的綜合征。正常情況下，自噬能維護(hù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，有利于細(xì)胞的存活，起到清除細(xì)胞內(nèi)垃圾的作用[4]。然而當(dāng)刺激因素到達(dá)一定時間，刺激強(qiáng)度超過一定范圍時，會出現(xiàn)不利于細(xì)胞存活的作用，正確認(rèn)識細(xì)胞自噬的雙重作用及其具體的分子機(jī)制有利于ARDS的防治[5-6]。

HMGB1廣泛分布于肺、腦、肝、心、腎等各器官。在細(xì)胞核內(nèi)，HMGB1可與DNA非特異性結(jié)合，參與復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)等過程，參與多種生命活動，病理情況下，胞內(nèi)HMGB1可通過主動分泌與被動釋放進(jìn)入胞外，進(jìn)而參與炎性反應(yīng)，HMGB1在炎癥過程中起重要作用[7]。細(xì)胞外的HMGBl通過促進(jìn)核因子(NF)-kB的核易位而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而誘導(dǎo)ARDS，參與細(xì)胞凋亡和自噬[8-9]。HMGB1作為膿毒癥的晚期炎癥因子，據(jù)報道，內(nèi)毒素誘導(dǎo)動物模型中，HMGB1在誘導(dǎo)后8 h時表達(dá)明顯增高，至32 h仍然維持較高水平[10]。有關(guān)HMGB1和自噬在ARDS肺上皮細(xì)胞損傷的研究表明，自噬激活劑可抑制LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的凋亡，并改善小鼠ARDS的肺損傷[11]。研究還發(fā)現(xiàn)LPS刺激A549 細(xì)胞產(chǎn)生自噬和ACD，自噬表達(dá)量依賴于LPS的作用的時間和濃度，自噬激活劑可加重細(xì)胞損傷[12]。可見，自噬對細(xì)胞具有雙重作用。研究也發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激過程中，HMGB1能促進(jìn)自噬，抑制HMGB1出核可以降低ARDS的自噬和減少細(xì)胞死亡[13]。HMGB1和自噬與ARDS的肺損傷發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切。

本研究結(jié)果顯示，正常組A549細(xì)胞自噬水平表達(dá)很低，使用最低劑量的細(xì)胞毒性的LPS作用于A549細(xì)胞24 h后HMGB1和自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的表達(dá)量增加，并出現(xiàn)不依賴于凋亡、壞死的細(xì)胞存活率下降。研究認(rèn)為ACD的特征為：胞質(zhì)中大量的自噬小體，無調(diào)亡小體形成和細(xì)胞核無變化，不依賴于caspase[14-15]。我們采用透射電鏡觀察到LPS可引起A549細(xì)胞自噬，且胞質(zhì)中出現(xiàn)了大量的自噬小體和自噬溶酶體，未見調(diào)亡小體形成，核膜完整等ACD的特征?？梢?，100 μg/ml的LPS作用于A549細(xì)胞24 h后可出現(xiàn)ACD。為了進(jìn)一步驗證HMGB1與A549細(xì)胞自噬和自噬性細(xì)胞死亡關(guān)系，實驗采用RNA干擾技術(shù)沉默HMGB1，結(jié)果通過干預(yù)后LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表達(dá)明顯下降，提示HMGB1可介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬與ACD。既往研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)高水平的自噬持續(xù)刺激，超出閾值時，對細(xì)胞是不利的，參與疾病的發(fā)生發(fā)展[16]，我們的研究與該研究相符。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生自噬及自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡，可能參與肺泡上皮細(xì)胞損傷過程，抑制HMGB1可降低LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的自噬。由此推測，當(dāng)膿毒癥的病情發(fā)生發(fā)展到一定階段，可引起肺泡上皮細(xì)胞ACD從而導(dǎo)致了ARDS的發(fā)生，由此可對ARDS患者進(jìn)行自噬表達(dá)的檢測，根據(jù)自噬表達(dá)量，通過干預(yù)HMGB1來調(diào)節(jié)自噬有望成為ARDS治療的靶點。