鞏奇明，李德慧，龔元?jiǎng)?，姜艷

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 百色 533000)

膿毒癥是臨床常見(jiàn)的炎癥反應(yīng)綜合征。心肌炎是該綜合征常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致心力衰竭以及患者死亡[1]。心肌炎主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加，炎癥因子大量分泌，細(xì)胞內(nèi)鈣超載和細(xì)胞凋亡等[2]。目前，對(duì)心肌炎發(fā)病機(jī)制的研究仍不夠全面和深入。

鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶[3]，也是鈣/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白(Ca2+/CaM)信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶[4]，參與心肌細(xì)胞死亡、心肌肥大、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注以及心律失常等多種病理過(guò)程[3-8]。但是目前CaMK Ⅱ在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。

本研究采用LPS(細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的主要啟動(dòng)因子)構(gòu)建體外心肌細(xì)胞炎癥模型，通過(guò)觀察抑制CaMK Ⅱ是否對(duì)LPS所致心肌細(xì)胞胞漿鈣含量及ROS水平具有調(diào)控作用，從中探討CaMK Ⅱ在該作用中的具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞(H9C2)購(gòu)自上海中喬新舟生物公司。

1.1.2 主要試劑 高糖型DMEM培養(yǎng)基(C1199-5500BT，Gibco)；胎牛血清(FSP500，ExCell Bio)；qPCR SYBR Green Master Mix (11201ES08，翊圣)；RT First Starand cDNA 第一鏈合成試劑盒(D71-68M，碧云天)；LPS (L2880，Sigma)；PCR引物合成(上海捷瑞)；EDTA-胰蛋白酶(25200056，Gibco)；KN93(HY-15465，MCE)；鈣離子熒光探針(Fluo-3 AM，40703ES50，翊圣)；Hanks平衡鹽溶液(HBSS，60161ES76，翊圣)；活性氧ROS試劑盒(s0033s，碧云天)；多克隆兔抗CaMK Ⅱ、單克隆鼠抗GAPDH、山羊抗兔IgG (H+L) HRP、山羊抗鼠IgG (H+L) HRP (AF6434、T0001、S0001、S0002、Affinity Biosciences)、BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光溶液均購(gòu)自上海雅酶公司。

1.2 細(xì)胞分組與建模 在37℃，5% CO2條件下，使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，消化，離心，重懸，計(jì)數(shù)，接種于孔板或平皿中(接種密度6孔板為2×105個(gè)/孔；共聚焦培養(yǎng)皿為5×104個(gè)/平皿；30 mm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿為2×106個(gè)/平皿)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS組、KN93 + LPS組。對(duì)照組不做特殊處理；LPS組：采用10.0 μg/ml的LPS作用于細(xì)胞48 h；KN93 + LPS組：先用5.0 μmol/L的KN93作用于細(xì)胞1 h，隨后加入10.0 μg/ml的LPS刺激細(xì)胞48 h。

1.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞胞漿Ca2+熒光檢測(cè) LPS作用結(jié)束后，取共聚焦培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，棄除細(xì)胞培養(yǎng)基，HBSS溶液清洗細(xì)胞3次，使用5.0 μM的Flou-3 AM工作液，37℃孵育45 min。隨后去除工作液，再次清洗細(xì)胞3次，并用HBSS溶液覆蓋細(xì)胞，37℃繼續(xù)孵育20 min。最后采用激光共聚焦顯微鏡(FV3000，日本Olympus)掃描成像。

1.3.2 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 取處理后的細(xì)胞，加入200 μl濃度為10.0 μmol/L的熒光探針DCFH-DA，37℃孵育20 min。使用DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，隨后采用激光共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.3.3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 取藥物處理后的細(xì)胞，清除上清液，每個(gè)平皿加入1.0 ml TRIzol試劑提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，使用微量紫外分光光度計(jì)(TGEM Plus，北京天根)測(cè)定RNA濃度及OD260/OD280值。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反逆錄，獲得cDNA單鏈；使用SYBR Green Master Mix試劑在qPCR儀(Light Cycler 9600，德國(guó)羅氏)進(jìn)一步擴(kuò)增樣本中的cDNA。各基因引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件為：95℃，10 min；95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，30 s。共計(jì)45個(gè)循環(huán)。樣本均設(shè)有3個(gè)復(fù)孔。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)含量。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)各基因引物序列

1.3.4 Western Blot實(shí)驗(yàn) 取處理后的細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄除細(xì)胞上清液，并用4℃的PBS清洗細(xì)胞2次。向培養(yǎng)皿中加入400 μl RIPA細(xì)胞裂解液(內(nèi)含1% PMSF)，提取細(xì)胞總蛋白。50 μg蛋白樣本用于聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至孔徑為0.45 μm的PVDF膜上，室溫封閉10 min，使用1∶1000稀釋后的一抗溶液4℃孵育過(guò)夜。在1∶2000的HRP標(biāo)記的山羊抗兔(或抗鼠)IgG抗體溶液中室溫孵育50 min。使用ECL發(fā)光溶液，進(jìn)行曝光成像。采用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算心肌細(xì)胞中CaMK Ⅱ蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 抑制CaMK Ⅱ可降低LPS所致細(xì)胞胞漿Ca2+增加 熒光探針檢測(cè)結(jié)果顯示：經(jīng)LPS處理后細(xì)胞胞漿Ca2+水平升高，且高于對(duì)照組。而在KN93+LPS組細(xì)胞中LPS對(duì)Ca2+的增加作用被抑制。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌細(xì)胞胞漿Ca2+含量檢測(cè)(800 ×，400 ×)

2.2 抑制CaMK Ⅱ可降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS增加 分析ROS熒光圖：與對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度強(qiáng)于對(duì)照組。而KN93預(yù)處理的KN93 + LPS組細(xì)胞中，ROS水平低于LPS組。見(jiàn)圖2。

圖2 各組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè)(800×)

2.3 細(xì)胞內(nèi)CaMK Ⅱ、受磷蛋白(PLB)、心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA)、無(wú)翅型小鼠乳腺腫瘤病毒整合位點(diǎn)家族成員4(Wnt4)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、原癌基因(c-Myc)、G1/S-特異性周期蛋白D1(Cyclin D1)、誘導(dǎo)型一氧化氮(iNOS)、白介素10(IL-10)、mRNA表達(dá)水平。

2.3.1 KN93降低LPS對(duì)CaMK Ⅱ的促進(jìn)作用 RT-qPCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：LPS能顯著增加心肌細(xì)胞中CaMK Ⅱ mRNA和蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而在KN93+LPS組，KN93預(yù)處理顯著降低CaMK Ⅱ的mRNA和蛋白水平，與LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組比較，** P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01。圖3 各組心肌細(xì)胞內(nèi)CaMK ⅡmRNA(A)和蛋白(B)水平檢測(cè)

2.3.2 抑制CaMK Ⅱ可緩解LPS對(duì)PLB和SERCA mRNA的抑制作用 LPS組細(xì)胞受LPS影響，細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)控蛋白PLB和SERCA mRNA表達(dá)水平降低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而在KN93+LPS組，PLB和SERCA mRNA表達(dá)升高，與LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

注：與對(duì)照組比較，** P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01。圖4 各組心肌細(xì)胞內(nèi)PLB和SERCA mRNA水平檢測(cè)

2.3.3 抑制CaMK Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)的Wnt4和β-catenin mRNA水平的影響 LPS組細(xì)胞受LPS影響，Wnt4和β-catenin mRNA表達(dá)水平升高，且高于對(duì)照組(P<0.05或0.01)。對(duì)比于LPS組，KN93 + LPS組細(xì)胞內(nèi)Wnt4 mRNA表達(dá)水平的降低(P<0.05)，而β-catenin mRNA含量水平無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

注：與對(duì)照組比較，** P<0.01，* P<0.05；與LPS組比較，##P<0.01，#P<0.05。圖5 各組心肌細(xì)胞內(nèi)Wnt4和β-catenin mRNA水平檢測(cè)

2.3.4 抑制CaMK Ⅱ?qū)PS誘導(dǎo)的c-Myc和Cyclin D1 mRNA水平的影響 LPS組細(xì)胞內(nèi)c-Myc和Cyclin D1的mRNA水平顯著增加，對(duì)比于對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而在KN93 + LPS組，KN93可降低LPS對(duì)Cyclin D1 mRNA的促進(jìn)作用(對(duì)比LPS組，P<0.05)。見(jiàn)圖6。

注：與對(duì)照組比較，** P<0.01，* P<0.05；與LPS組比較，#P<0.05。圖6 各組心肌細(xì)胞內(nèi)c-Myc和Cyclin D1 mRNA水平檢測(cè)

2.3.5 抑制CaMK Ⅱ可降低LPS誘導(dǎo)的iNOS和IL-10 mRNA水平 對(duì)比于對(duì)照組，LPS組細(xì)胞內(nèi)iNOS和IL-10 mRNA水平顯著增加(P<0.01)。而KN93+LPS組內(nèi)iNOS和IL-10 mRNA水平低于LPS組(P<0.05或<0.01)。見(jiàn)圖7。

注：與對(duì)照組比較，** P<0.01；與LPS組比較，##P<0.01，#P<0.05。圖7 各組心肌細(xì)胞內(nèi)iNOS和IL-10 mRNA水平檢測(cè)

3 討論

心肌細(xì)胞胞漿中的Ca2+含量受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體共同調(diào)控[6]，同時(shí)也受多種鈣離子通道以及鈣離子調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的共同影響。心肌細(xì)胞被LPS損傷后，細(xì)胞內(nèi)受磷蛋白PLB功能下降，肌質(zhì)網(wǎng)攝取鈣減少，細(xì)胞膜上的鈉鈣交換減少，細(xì)胞胞漿Ca2+不能及時(shí)降低至正常水平，造成細(xì)胞胞漿鈣超載，導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡[9]，損傷心肌細(xì)胞興奮收縮功能[1-2]。研究表明[6]，KN93通過(guò)抑制CaMK Ⅱ的活性并降低其磷酸化水平，從而對(duì)CaMK Ⅱ發(fā)揮特異性抑制作用。研究證實(shí)，KN93抑制CaMK Ⅱ，降低缺血再灌注損傷鈣波的產(chǎn)生，從而降低再灌性心律失常的發(fā)生。KN93抑制CaMK Ⅱ活性，可有效降低LPS所致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，與上述結(jié)果一致。

此外，LPS誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)度增加，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[10]，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[11]。本研究表明，CaMK Ⅱ表達(dá)降低可減少細(xì)胞ROS含量，防止ROS對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)一步損傷。

Wnt信號(hào)通路有Wnt經(jīng)典通路和Wnt非經(jīng)典通路兩種。Wnt經(jīng)典通路，又稱(chēng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，具有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖以及凋亡的作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路可作為心血管疾病發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物，參與心肌損傷及修復(fù)調(diào)控。在LPS損傷心肌細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到Wnt/β-catenin表達(dá)增加[12]，β-catenin從細(xì)胞膜上不斷進(jìn)入細(xì)胞漿，并在胞漿內(nèi)大量聚集。當(dāng)β-catenin濃度過(guò)高時(shí)，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)和C-myc等細(xì)胞肥大相關(guān)基因，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大性病變[13]。Wnt非經(jīng)典通路又分為Wnt/Ca2+通路和Wnt/JNK通路。Wnt/Ca2+通路下游信號(hào)分子有磷脂酶C、鈣離子、CaMK Ⅱ等分子。胞漿Ca2+增加可激活CaMK Ⅱ進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)肥大相關(guān)蛋白的活性，進(jìn)一步加速心肌肥大病程[13]。Wnt/JNK通路下游有C-Jun氨基末端激酶(JNK)和細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子C-Jun等分子[13]，該通路的激活與心肌肥大、纖維化等病理過(guò)程相關(guān)。本研究觀察到LPS損傷的心肌細(xì)胞中，Wnt/β-catenin、c-Myc/CyclinD1的活性均增加；而抑制CaMK Ⅱ表達(dá)，可顯著抑制Wnt4、CyclinD1 mRNA的表達(dá)水平。

作為非Ca2+依賴(lài)型NOS亞型，iNOS受LPS刺激后大量增加，并能夠持續(xù)性大量釋放NO[14]。此外，暴露于LPS的心肌細(xì)胞可分泌大量炎性因子(TNF-a、IL-1β以及IL-6等)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)抑制CaMK Ⅱ的表達(dá)可抑制iNOS、IL-10轉(zhuǎn)錄，降低炎性反應(yīng)的進(jìn)一步發(fā)展。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CaMK Ⅱ通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白PLB、SERAR，Wnt通路的Wnt4、CyclinD1，以及炎癥通路的iNOS、IL-10的基因表達(dá)水平，減輕LPS所致的心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+和ROS水平增加。這表明CaMK Ⅱ可能是膿毒癥心肌炎的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。但本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚不夠完善，還需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。