翟云芝，張浩然，石默晗

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 蚌埠 233004)

目前，乳腺癌作為對女性危害最大的惡性腫瘤問題，嚴(yán)重影響了女性健康[1]。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是較為特殊的乳腺癌亞型，代表相應(yīng)的雌激素(estrogen receptor，ER)、孕激素(progesterone receptor，PR)與人表皮生長因子(human epidermal growth factor receptor，HER-2)三類受體都表現(xiàn)為陰性，這一特殊亞型由于缺乏治療靶點，治療手段單一，又非常容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)及內(nèi)臟轉(zhuǎn)移，目前5年生存率不足30%[2]。TNBC目前在治療上以化療為主，缺少更多其他有效的治療措施。因此，TNBC在治療方面迫切需要尋求新的治療靶點，以提高TNBC的治療效果[3]。而微小RNA(miRNA)是近年腫瘤研究的熱點，其在真核細胞的基因表達、細胞分化等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miRNA作為轉(zhuǎn)錄長度為18～22 個核苷酸的非編碼RNA，依靠和靶基因3′UTR的結(jié)合，進一步實現(xiàn)控制mRNA的效果，在很多腫瘤的進展過程中都有重大的影響[4]。miR-146a是miRNAs家族非常重要的成員，對于惡性腫瘤的產(chǎn)生、進展有非常關(guān)鍵的調(diào)控作用，該部分的實際表達和惡性腫瘤的進展與侵襲等存在緊密聯(lián)系，相關(guān)報道得出miR-146a在胃癌、肺癌等腫瘤的實際表達有明顯下調(diào)，miR-146a下調(diào)有助于調(diào)節(jié)癌變部分的增殖[5]。但是通過分析與追蹤學(xué)術(shù)領(lǐng)域的最新研究課題，對TNBC的miR-146a表達和臨床病理間的聯(lián)系，少見有報道。通過對miRNA基因庫開展篩查，即可發(fā)現(xiàn)miR-146a或許和乳腺癌存在聯(lián)系，或許有調(diào)控增殖與加速血管生成的效果。所以，對此我們運用實時熒光定量PCR法，進一步測定miR-146a的具體指標(biāo)，判斷該指標(biāo)和細胞增殖的聯(lián)系，對更為深入的研究TNBC機制與進展問題，提供更加可靠的數(shù)據(jù)與理論支持。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選定2015年1月—2015年11月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院60例TNBC患者作為研究對象。所有患者均為初治患者，且符合TNBC的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)有經(jīng)驗的病理醫(yī)生復(fù)核切片免疫組化及FISH確診；年齡35～67歲，中位年齡51歲，癌旁正常的乳腺組織作為此次分析的對照組，留取術(shù)后新鮮組織(-80℃環(huán)境存儲)與石蠟包埋組織。

1.2 方法

1.2.1 miR-146a的測定方案 使用新鮮凍存標(biāo)本開展miR-146a測定，測定方法是熒光PCR，首要步驟為獲取相應(yīng)的總RNA。使用TRIzol試劑盒提取總RNA，總RNA濃度通過測量來評估。使用NanoDrop分光光度計在260 nm和280 nm處的吸光度。將提取的總RNA按RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse-aid-first-strang-cDNA合成試劑盒購自Synthesis Thermo Fisher Scientific 公司)說明反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，合成的 cDNA使用TB GreenTM Primix Ex TaqTM試劑盒(Takara Bio 公司)通過 PCR 儀進行擴增檢測，以U6為內(nèi)參檢測各組miR-146a表達。此次設(shè)計采用的miR-146a引物[6]：上游：5′-CTATCGGGAACGACCG-3′；下游：5′-ACACATTGAAGGTCCCCTT-3′；同時運用U6為內(nèi)參。PCR反應(yīng)設(shè)置：95℃ 5 min，對此進行1次循環(huán)的操作；95℃ 25 s ，64℃ 20 s，72℃ 20 s，15 個循環(huán)；93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，35個循環(huán)。60℃的時間點獲取熒光訊號，記載相應(yīng)的Ct值。應(yīng)用2-ΔΔCt法分析詳細表達狀態(tài)。ΔΔCt=[ Ct目的基因(未知)-CtGAPDH(未知)]-[Ct目的基因(校正樣品)-CtGAPDH(校正樣品)]。

1.2.2 免疫組化方法 使用石蠟包埋組織進行免疫組化檢測。在此次方案設(shè)計中，實際運用的Ki67與VEGF試劑，都源自于北京金橋，方案中運用了二步法、DAB顯色的處理方案。對Ki67的表達位置在細胞核，表達相對明顯的3個高倍(400倍)位置分析具體的陽性率數(shù)據(jù)，采用Ki67陽性率為此次分析所運用的增值指數(shù)。VEGF評估方案：陽性位置位于細胞質(zhì)，對此選擇3個高倍(400倍)觀察視角，依次開展陽性率和著色強度的計算工作。陽性率：<25%在此次分析中判定為1分，26%～50%在此次分析中判定為2分，51%～75%在此次分析中判定為3分，>75%在此次分析中判定為4分。著色強度：沒有色彩歸入0分，淡黃歸入到1分，棕黃歸入到2分，棕褐則是歸入到3分。兩個數(shù)據(jù)進行乘法計算，為此次分析的最后評分，實際區(qū)間是0～12分。安排有豐富經(jīng)驗的醫(yī)師，運用盲法的方式進行診斷。

2 結(jié)果

2.1 TNBC癌組織及癌旁組織中miR-146a的表達 兩組組織的miR-146a表達量區(qū)別顯著，存在統(tǒng)計學(xué)價值(P<0.001)，觀察組內(nèi)miR-146a的具體表達數(shù)據(jù)顯著小于對照組(見表1、圖1 ) 。

圖1 兩組中miR-146a 表達的柱狀圖

表1 TNBC癌組織及癌旁組織中miR-146a的表達

2.2 觀察組不同臨床病理特征中miR-146a的表達 觀察組中miR-146a的表達指標(biāo)分析，可發(fā)現(xiàn)是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同TNM分期都有顯著的區(qū)別，該區(qū)別存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。在年齡、腫瘤大小與分化不同方面并不存在統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同臨床病理特征中 miR-146a表達比較

2.3 觀察組中miR-146a與增殖指數(shù)的關(guān)系 使用Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)觀察組中miR-146a的指標(biāo)和增殖指數(shù)之間表現(xiàn)為負相關(guān)的關(guān)系 (r=-0.909 ，P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-146a與增值指數(shù)的關(guān)系散點圖

2.4 觀察組中 miR-146a與 VEGF的關(guān)系 使用Pearson相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)觀察組中miR-146a的指標(biāo)和VEGF之間表現(xiàn)為負相關(guān)的聯(lián)系(r=-0.960 ，P<0.05)。見圖3。

圖3 miR-146a與VEGF的關(guān)系散點圖

3 討論

TNBC是一類具有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害了女性健康。大約15%～20%的乳腺癌患者為TNBC[7]。在過去的幾十年中，隨著治療手段的增加和治療水平的提高，乳腺癌的治療效果得到了顯著提升，5年生存率明顯提高，總體死亡率明顯下降。然而，由于TNBC腫瘤侵襲性強，更容易發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移。且治療手段單一，目前TNBC的治療仍以化療為主，缺乏內(nèi)分泌治療及抗HER-2治療靶點。3年的治療復(fù)發(fā)率高達40%～50%[8]，預(yù)后仍然很差。TNBC目前在治療方面迫切需要尋找新的治療靶點，以提高治療效果，改善患者的生存率。近年來微小RNA成為惡性腫瘤的研究熱點，其主要功能是在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用。miRNA作為非編碼單鏈小分子RNA，在各類細胞中都有較多的存在。miRNA為轉(zhuǎn)錄后重要的調(diào)控因子，對此可依靠目標(biāo)RNA的分解，進一步產(chǎn)生的控制表達的效果，也可對miRNA翻譯進行控制，有效調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的表達信息，其在實際的生長和發(fā)育等程序中，都發(fā)揮著非常重要的調(diào)節(jié)作用[9]。miR-146a位于5號染色體的LOC285628，成熟序列位置是第2外顯子。miR-146a水平在胃癌、膀胱癌等多種癌癥組織中存在異常表達[10-12]，但目前在TNBC的表達還未見報道。為尋找新的治療靶點，提高治療效果，本研究探討miR-146a 在TNBC中的表達及其臨床意義，結(jié)果顯示TNBC中miR-146a的表達明顯低于對照組，提示miR-146a或許為TNBC腫瘤產(chǎn)生的關(guān)鍵分子因素，或許會介入腫瘤的進展，miR-146a為重要的抑癌基因，也有相對較強的調(diào)節(jié)功能，miR-146a在異常增殖的場景中會有顯著影響，對調(diào)控失控性增殖也有顯著的促進效果。當(dāng)前，部分和臨床特征、預(yù)后存在密切聯(lián)系的標(biāo)志物，都獲得了業(yè)界的普遍關(guān)注。miR-146a為抑制基因的重要指標(biāo)，在多個腫瘤表達中都有所下調(diào)[13-15]。miR-146a是miRNA家族的重要成員，在多個實體腫瘤的表達都出現(xiàn)了下調(diào)，認(rèn)定其或許和腫瘤的出現(xiàn)與進展存在密切聯(lián)系。Shomali N等[16]分析得出，胃癌腫瘤的miR-146a表現(xiàn)為低表達的狀態(tài)，該指標(biāo)可能會影響癌癥遷移與侵襲，發(fā)現(xiàn)miR-146a可作為治療的抑制物，運用到相關(guān)診療活動中。但是當(dāng)前對TNBC組織的miR-146a表達和病理特征的聯(lián)系少有研究。本文的結(jié)果顯示觀察組不同臨床病理特征中miR-146a的表達在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與TNM多個分期的不同情況中，其表達都有顯著的區(qū)別，該區(qū)別存在統(tǒng)計學(xué)意義。在年齡、腫瘤大小與分化不同的表達區(qū)別較小，并不存在統(tǒng)計學(xué)意義。TNBC中miR -146a的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在聯(lián)系，代表miR-146a低表達或許和實際產(chǎn)生的侵襲、生長以及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，miR-146a低表達可使TNBC的腫瘤組織進入到生長狀態(tài)。此外，miR-146a表達也和TNBC不同TNM分期存在聯(lián)系，因為TNM分期可以判斷預(yù)后與生物學(xué)變化，所以miR-146a低表達或許也和TNBC腫瘤預(yù)后等變化存在聯(lián)系，即TNBC中miR-146a低表達或許代表預(yù)后也不理想。低表達miR-146a也代表實際疾病分期相對較高。此次分析還可發(fā)現(xiàn)，TNBC腫瘤內(nèi)miR-146a的表達指標(biāo)，和增殖指數(shù)間表現(xiàn)為顯著的負相關(guān)關(guān)系，代表miR-146a維持低表達的狀況，或許會造成腫瘤出現(xiàn)異常增殖，進一步促使腫瘤的發(fā)生與進展。miR-146a異常表達或許介入TNBC腫瘤的失控增殖，促進了惡性腫瘤細胞的快速生長，從而造成腫瘤體積的快速增大，使腫瘤的侵襲性變得增強。本組研究結(jié)果還顯示了TNBC腫瘤組織中miR-146a的表達與VEGF的表達表現(xiàn)為負相關(guān)聯(lián)系，miR-146a低表達可能加快VEGF的高表達，幫助腫瘤間質(zhì)的血管發(fā)育，提高腫瘤組織的營養(yǎng)供給，進一步加快腫瘤的生長。

整體而言，miR-146a低表達或許為腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵標(biāo)志，會影響腫瘤的進展與惡化，miR-146a低表達和細胞增殖與VEGF調(diào)控存在關(guān)系。目前由于TNBC在治療方面手段單一，迫切需要尋找新的治療靶點，腫瘤進展可能與腫瘤新生血管、信號通路等因素有關(guān)。另外，細胞周期和免疫缺陷可能也是影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要因素[17]。