田喆，岑麗蘭，蔣玉潔，廖品琥

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院重癥醫(yī)學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

核受體亞家族4A組成員1(NR4A1)定位于人12號(hào)染色體，是立刻早期反應(yīng)基因之一[1]。接受信號(hào)刺激后NR4A1分子構(gòu)象發(fā)生變化，通過(guò)對(duì)靶基因調(diào)控區(qū)的識(shí)別和結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，廣泛參與細(xì)胞分化和增殖、腫瘤發(fā)生和凋亡、代謝控制、血管重塑等環(huán)節(jié)[2-5]。泛癌分析是將多組學(xué)進(jìn)行整合分析，檢查不同癌癥類型中發(fā)現(xiàn)的基因組和表達(dá)變化之間的相似與差異[6]。盡管基于細(xì)胞或動(dòng)物的新證據(jù)支持NR4A1與癌癥之間的聯(lián)系，但目前鮮少有關(guān)于NR4A1泛癌分析可用。本研究通過(guò)癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO)，探索NR4A1在大多數(shù)腫瘤中的表達(dá)情況，并與其預(yù)后做相關(guān)性分析。分析NR4A1在癌癥中的表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)的關(guān)系。通過(guò)泛癌分析提供一個(gè)對(duì)NR4A1在不同腫瘤中致癌作用的相對(duì)全面的理解。

1 方法

1.1 基因表達(dá)情況 通過(guò)TIMER2(tumor immune estimation resource，version 2)工具挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中NR4A1在不同癌癥(或特定癌癥亞型)和正常組織中的表達(dá)差異。使用GEPIA2工具(gene expression profiling interactive analysis，version 2)來(lái)獲得癌癥組織與GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)正常組織之間表達(dá)差異的箱線圖(box plot)。參數(shù)設(shè)置：Log2FCcutoff=1，P-value cutoff=0.01。此外，還通過(guò)GEPIA2明確NR4A1在所有TCGA癌癥不同病理分期的表達(dá)水平，計(jì)算每百萬(wàn)轉(zhuǎn)錄本(transcript per million，TPM)值，用Log2(TPM+1)量表顯示NR4A1的表達(dá)水平并繪制成小提琴圖(violin plot)。明確基因表達(dá)水平后，利用Ualcan挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中NR4A1的蛋白表達(dá)水平。本次研究選取子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC)、肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)的有效數(shù)據(jù)集。

1.2 生存預(yù)后分析 通過(guò)GEPIA2獲取所有TCGA癌癥類型中NR4A1對(duì)總生存期(overall survival，OS)和無(wú)病生存期(disease-free survival，DFS)的生存貢獻(xiàn)。選擇合適的表達(dá)閾值以區(qū)分高表達(dá)人群和低表達(dá)人群(Cutoff-High=50%；Cutoff-Low=50%)。假設(shè)檢驗(yàn)采用Mentel-Cox 檢驗(yàn)，繪制單基因生存分析圖(Kaplan-Meier曲線)。

1.3 NR4A1基因變異情況 在超過(guò)28種疾病譜，總計(jì)10967個(gè)樣本數(shù)中，利用TCGA泛癌圖譜研究(TCGA pan cancer atlas studies)查詢NR4A1的基因改變特征，觀察所有TCGA腫瘤中NR4A1的突變頻率(alteration frequency)、突變類型(mutation type)以及拷貝數(shù)變化(copy number alteration)結(jié)果。比較TCGA癌癥病例中有無(wú)NR4A1基因改變對(duì)OS、DFS、無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和疾病特異生存率(disease-specific survival，DSS)影響差異數(shù)據(jù)，生成具有對(duì)數(shù)秩P值的Kaplan-Meier圖。

1.4 NR4A1蛋白磷酸化情況 通過(guò)uniprot軟件(https://www.uniprot.org/)找到NR4A1蛋白對(duì)應(yīng)的ID，然后輸入到SMART工具找到蛋白結(jié)構(gòu)域。利用Ualcan明確各種癌癥中的磷酸化位點(diǎn)及表達(dá)水平，并將提示的磷酸化位點(diǎn)組合到蛋白結(jié)構(gòu)域上。

1.5 免疫浸潤(rùn)分析 在TIMER2網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器中探索所有TCGA腫瘤中NR4A1表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)。著重介紹NR4A1與CAFs浸潤(rùn)的相關(guān)性，應(yīng)用EPIC、MCPCOUNTER、XCLL、TIDE算法進(jìn)行免疫浸潤(rùn)評(píng)估。腫瘤純度是本分析中主要的混雜因素[7]，根據(jù)純度調(diào)整后的Spearman’s等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)得到P值和偏相關(guān)系數(shù)(partial correlation，COR)值。數(shù)據(jù)以熱圖和散點(diǎn)圖的形式可視化。

1.6 NR4A1相關(guān)基因富集分析 使用STRING查詢蛋白名稱及物種(NR4A1；homo sapiens)，隨后設(shè)置以下參數(shù)：最低關(guān)系分?jǐn)?shù)(minimum required interaction score)設(shè)置為低可信度0.150；線條顏色表示交互證據(jù)的類型；顯示的交互對(duì)象的最大數(shù)量：不超過(guò)50個(gè)；交互來(lái)源：實(shí)驗(yàn)。最后，篩選出50個(gè)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的與NR4A1結(jié)合的蛋白。利用GEPIA2進(jìn)行相關(guān)性分析，基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)集，選取與NR4A1相關(guān)性前100的基因，并從中選取相關(guān)基因與NR4A1進(jìn)行成對(duì)基因的Pearson相關(guān)分析。散點(diǎn)圖采用log2TPM，給出P值和相關(guān)系數(shù)R。根據(jù)上一步選擇的相關(guān)性基因，制作所選基因與NR4A1的相關(guān)性熱圖。為了進(jìn)一步篩選基因，使用交互式韋恩圖(Venn diagram)查看器Jvenn將相關(guān)性的100個(gè)基因與蛋白互作的50個(gè)基因進(jìn)行交集分析。此外，把兩組數(shù)據(jù)合并進(jìn)行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析。通過(guò)將基因列表上傳至DAVID(database for annotation，visualization，and integrated discovery)，并選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”和“homo sapiens”分別作為基因標(biāo)識(shí)符和物種，獲得了功能注釋圖的數(shù)據(jù)。最后用一種用于數(shù)據(jù)分析和可視化的在線平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn)繪制氣泡圖顯示富集的通路。此外，還應(yīng)用該平臺(tái)進(jìn)行了GO(gene ontoligy)富集分析。對(duì)生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)的數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析 首先分析NR4A1在不同細(xì)胞和非腫瘤組織中的表達(dá)模式，如圖1所示。根據(jù)人類蛋白圖譜(human protein atlas，HPA)、GTEx和哺乳動(dòng)物基因組功能注釋5(function annotation of the mammalian genome 5，F(xiàn)ANTOM5)數(shù)據(jù)集的組合，發(fā)現(xiàn)NR4A1在腎上腺、支氣管、睪丸中蛋白表達(dá)最高，其次是大腦皮層和海馬區(qū)(見(jiàn)圖1a)。然而，NR4A1在所有檢測(cè)到的組織中都有表達(dá)，顯示出較低的組織特異性。當(dāng)分析HPA/Monaco/Schmiedel數(shù)據(jù)集中不同血細(xì)胞中的NR4A1 mRNA表達(dá)時(shí)，出現(xiàn)血細(xì)胞類型特異性富集組：非經(jīng)典單核細(xì)胞(non-classical monocyte)、中間單核細(xì)胞(intermediate monocyte)(見(jiàn)圖1b)。另外，分析單細(xì)胞類型中NR4A1 mRNA表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)2型肺泡上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、粒細(xì)胞中NR4A1 mRNA水平增強(qiáng)(見(jiàn)圖1c)。利用肽圖譜(peptide atlas)中基于質(zhì)譜的血漿蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行量化，未檢測(cè)到血漿中NR4A1的蛋白濃度，預(yù)計(jì)細(xì)胞內(nèi)NR4A1蛋白未主動(dòng)分泌到血液中。

注：a：組織中NR4A1蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)集；b：血液細(xì)胞中NR4A1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集；c：?jiǎn)渭?xì)胞中NR4A1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)來(lái)自HPA、GTEx、FANTOM5轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集合。圖1 有關(guān)NR4A1在正常組織/細(xì)胞/血液中的數(shù)據(jù)集合

TIMER2工具挖掘TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中NR4A1基因在各種癌癥中表達(dá)狀況(見(jiàn)圖2a)。NR4A1在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA)、乳腺浸潤(rùn)癌(breast invasive carcinoma，BRCA)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSC)、腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)、肝細(xì)胞肝癌(liver hepatocellular carcinoma，LIHC)、肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)、肺鱗癌(lung squamous cell carcinoma，LUSC)、甲狀腺癌(thyroid carcinoma，THCA)、子宮內(nèi)膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC)組織中的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組(P<0.001)。

后續(xù)將TCGA與GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合進(jìn)行分析，補(bǔ)充GTEx數(shù)據(jù)集的正常組織作為對(duì)照，進(jìn)一步評(píng)估NR4A1在急性髓細(xì)胞樣白血病(acute myeloid leukemia，LAML)、卵巢漿液性囊腺癌(ovarian serous cystadenocarcinoma，OV)、睪丸癌(testicular germ cell tumors，TGCT)、胸腺癌(thymoma，THYM)的正常組織和癌癥組織中的表達(dá)差異(P<0.01)，見(jiàn)圖2b。對(duì)于腎上腺皮質(zhì)癌(adrenocortical carcinoma，ACC)、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma，DLBC)、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤(brain lower grade glioma，LGG)、肉瘤(sarcoma，SARC)沒(méi)有得到顯著性差異。

NR4A1總蛋白在LUAD、UCEC組織中的表達(dá)均低于正常組織(P<0.001)，見(jiàn)圖2c。我們還觀察到NR4A1與BLCA、宮頸鱗癌和腺癌(cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC)、腎嫌色細(xì)胞癌(kidney chromophobe，KICH)、TGCT、UCEC病理分期有關(guān)(P均<0.05)，見(jiàn)圖2d，其他癌癥與之無(wú)關(guān)。

注：a：分析NR4A1在不同腫瘤或特定腫瘤亞型中的表達(dá)情況，*P<0.05; **P<0.01;***P<0.001；b：TCGA中ACC、DLBC、LAML、LGG、OV、SARC、TGCT、THYM，以GTEx中相應(yīng)正常組織為對(duì)照所*P<0.001；c：LUAD、UCEC正常組織與原發(fā)癌癥組織中NR4A1總蛋白表達(dá)水平，作箱線圖，***P<0.001；d：分析BLCA、CESC、KICH、KIRC、TGCT、UCEC主要病理分期的表達(dá)水平，采用Log2(TPM+1)為對(duì)數(shù)標(biāo)尺。圖2 NR4A1基因在不同腫瘤和病理分期中的表達(dá)水平

2.2 生存數(shù)據(jù)分析 根據(jù)NR4A1表達(dá)水平將腫瘤劃分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。如圖3a所示，高表達(dá)的NR4A1與KICH(P=0.027)、KIRC(P=0.009)總體預(yù)后不良有關(guān)。NR4A1基因低表達(dá)與STAD不良OS有關(guān)(P=0.011)。DFS分析數(shù)據(jù)顯示(見(jiàn)圖3b)，KICH與DFS無(wú)明確相關(guān)(P=0.085)，KIRC的NR4A1高表達(dá)與DFS預(yù)后不良存在相關(guān)性。有趣的是，高表達(dá)的NR4A1與THCA總體OS預(yù)后差有關(guān)，但卻表現(xiàn)出與短期DFS預(yù)后良好的相關(guān)性。

注：對(duì)TCGA中不同腫瘤的總生存期(a)和無(wú)病生存期(b)進(jìn)行NR4A1基因表達(dá)分析，得出Kaplan-Meier曲線。圖3 TCGA中NR4A1表達(dá)與腫瘤生存預(yù)后的關(guān)系

2.3 基因變異分析 以NR4A1擴(kuò)增為主要變異類型的ACC癌癥患者NR4A1基因改變頻率最高(>5%)。UCEC以NR4A1突變?yōu)橹?，其改變頻率>3%。值得注意的是，基因改變大約1%的LGG絕大多數(shù)都是NR4A1拷貝數(shù)缺失(見(jiàn)圖4a)。進(jìn)一步顯示NR4A1遺傳變異的類型和位點(diǎn)(見(jiàn)圖4b)，我們發(fā)現(xiàn)NR4A1錯(cuò)義突變是主要的遺傳變異類型。在1例UCEC、1例COAD、1例LUAD病例中檢測(cè)出C4型鋅指結(jié)構(gòu)域中X292_splice能夠使NR4A1基因292號(hào)位點(diǎn)發(fā)生拼接突變。之后，還探討了NR4A1基因改變與不同類型癌癥患者臨床預(yù)后之間的潛在聯(lián)系。與無(wú)NR4A1基因改變的病例相比，NR4A1改變后與LUAD患者的OS(P=0.174)、PFS(P=0.846)、 DFS(P=0.304)、DSS(P=0.431)無(wú)顯著相關(guān)(見(jiàn)圖4c)。

2.4 蛋白磷酸化分析 圖5a描繪的是NR4A1蛋白結(jié)構(gòu)域的示意圖。通過(guò)CPTAC數(shù)據(jù)集，比較正常組織與原發(fā)腫瘤組織中NR4A1磷酸化水平的變化，總結(jié)出NR4A1磷酸化水平發(fā)生顯著性差異的腫瘤類型：LUAD。LUAD組織中S218位點(diǎn)上磷酸化水平低于正常組織(P<0.001)，見(jiàn)圖5b。這一觀察結(jié)果值得進(jìn)一步的分子檢測(cè)，以進(jìn)一步探討NR4A1磷酸化在腫瘤發(fā)生中的潛在作用。

2.5 免疫浸潤(rùn)分析 觀察到BLCA、BRCA、HNSC(包括HNSC+HPV-)、KIRP、LUSC、MESO、STAD、UCS各種癌癥中NR4A1的表達(dá)與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn)成正相關(guān)，而在TGCT呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(見(jiàn)圖6a)。在此，僅將上述腫瘤其中一種算法產(chǎn)生的相關(guān)性散點(diǎn)圖作為代表展現(xiàn)(見(jiàn)圖6b)。

2.6 NR4A1相關(guān)基因的富集分析 首先篩選出NR4A1靶向結(jié)合蛋白以及與NR4A1表達(dá)相關(guān)基因，然后再進(jìn)行一系列通路富集分析。基于STRING，共篩選出50個(gè)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的與NR4A1結(jié)合蛋白。圖7a顯示了這些蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用GEPIA2結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)性分析，并選取與NR4A1相關(guān)性前100的基因。NR4A1的表達(dá)水平與CSRNP1(R=0.72)、ATF3(R=0.7)、NR4A3(R=0.67)、ZFP36(R=0.66)、CYR61(R=0.64)的表達(dá)水平呈正相關(guān)(見(jiàn)圖7b)。熱圖顯示(見(jiàn)圖7c)，在絕大多數(shù)的癌癥類型中，NR4A1與上述基因成正相關(guān)。進(jìn)一步篩選基因，將相關(guān)性Top100基因與蛋白互作的50個(gè)基因取交集并篩選出2個(gè)共同成員(SMAD7、MIDN)(見(jiàn)圖7d)。

注：顯示了變異類型(a)和突變位點(diǎn)(b)的改變頻率。展示出NR4A1改變頻率最高的突變位點(diǎn)(X292_spilice)。該突變位點(diǎn)與LUAD的OS、PFS、DFS、DSS之間的潛在相關(guān)性。圖4 TCGA中不同腫瘤NR4A1變異類型

注：NR4A1磷酸化蛋白(S218位點(diǎn))在正常組織和癌癥原發(fā)灶中的表達(dá)水平。蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖(a)顯示磷酸化位點(diǎn)位置。LUAD在S218磷酸化表達(dá)情況(b)。圖5 NR4A1蛋白磷酸化分析

注：采用不同的算法探討TCGA各類型癌癥中NR4A1基因的表達(dá)水平與癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)水平之間的潛在相關(guān)性。用熱圖(a)和相關(guān)性散點(diǎn)圖(b)表示。圖6 NR4A1表達(dá)與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞免疫浸潤(rùn)之間的相關(guān)性分析

注：利用STRING工具獲得了現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)確定的NR4A1結(jié)合蛋白(a)。TCGA項(xiàng)目中排名前100位的SND1相關(guān)基因(b)，并分析了NR4A1與所選靶向基因的表達(dá)相關(guān)性，繪制相應(yīng)的熱圖(c)。對(duì)SND1結(jié)合基因和相關(guān)基因進(jìn)行了交叉分析(d)。圖7 NR4A1相關(guān)基因篩選

把上述兩組數(shù)據(jù)合并進(jìn)行KEGG和GO富集分析。KEGG數(shù)據(jù)表明，NR4A1在癌癥發(fā)病機(jī)制中的作用可能與甲狀腺激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑(thyroid hormone signaling pathway)、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒1型感染(HTLV-1 infection)、MAPK信號(hào)通路有關(guān)(見(jiàn)圖8a)。GO富集分析進(jìn)一步表明，這些基因大多數(shù)與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，并且大多數(shù)基因編碼產(chǎn)物定位在細(xì)胞核上，發(fā)揮著結(jié)合蛋白質(zhì)的分子功能(見(jiàn)圖8b)。

注：根據(jù)NR4A1結(jié)合和相互作用的基因，進(jìn)行了KEGG通路分析(a)和GO分析(b)。圖8 NR4A1 KEGG富集分析和GO分析

3 討論

通過(guò)檢索文獻(xiàn)，我們沒(méi)有檢索到任何從整體角度對(duì)NR4A1進(jìn)行泛癌分析的文獻(xiàn)。因此，有機(jī)會(huì)基于TCGA、CPTAC和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，通過(guò)基因表達(dá)、基因改變、蛋白磷酸化等分子特征對(duì)不同腫瘤中的NR4A1基因進(jìn)行較為全面的檢測(cè)分析。我們想表示出NR4A1在癌癥組織和正常組織的表達(dá)高低，但是TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中某些癌癥缺少相鄰正常對(duì)照或癌旁組織高度受限。例如ACC、DLBC等，所以將TCGA與GTEx(genotype-tissue expression)數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合進(jìn)行分析。Ualcan作為一個(gè)全面的、交互式網(wǎng)絡(luò)資源[8]，我們通過(guò)門(mén)戶網(wǎng)站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析癌癥Omics數(shù)據(jù)，使本次研究能夠?qū)εR床蛋白質(zhì)組腫瘤分析聯(lián)盟(clinical proteomic tumor analysis consortium，CPTAC)確認(rèn)/發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)分析。

我們觀察到NR4A1在大多數(shù)腫瘤中低表達(dá)。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中BLCA、BRCA、HNSC、LUAD、LUSC、LIHC、THCA、UCEC癌組織中NR4A1基因表達(dá)低于正常組織。通過(guò)以往文獻(xiàn)已知，NR4A1過(guò)表達(dá)抑制子宮內(nèi)膜樣癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。Wu HM等[10]研究三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)時(shí)發(fā)現(xiàn)TNBC中NR4A1表達(dá)降低，NR4A1過(guò)表達(dá)抑制TNBC生長(zhǎng)和侵襲性。也有報(bào)道稱NR4A1是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)有效抑癌因子，在人AML中被沉默，而基因的缺失導(dǎo)致AML在小鼠出生后快速發(fā)展[11]。然而，現(xiàn)已報(bào)道的文獻(xiàn)中，有關(guān)NR4A1在癌癥中的作用是矛盾的。miR-506通過(guò)減少NR4A1表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移[12]。NR4A1在乳腺癌患者中的過(guò)度表達(dá)是降低生存率和增加轉(zhuǎn)移的預(yù)后因素[13]。這些爭(zhēng)議的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了NR4A1在不同癌癥類型或者亞型發(fā)揮特定作用的可能性。從CPTAC數(shù)據(jù)庫(kù)中得到NR4A1總蛋白和磷酸化蛋白數(shù)據(jù)結(jié)果表明，LUAD原發(fā)腫瘤組織中S218位點(diǎn)總蛋白和磷酸化蛋白水平相比正常對(duì)照較低。提示NR4A1蛋白磷酸化水平下調(diào)是促進(jìn)LUAD發(fā)生的原因。需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)評(píng)估NR4A1 S218位點(diǎn)磷酸化在癌癥發(fā)生中的作用。

在Hedrick E等[13]的研究中發(fā)現(xiàn)NR4A1在乳腺癌患者中的過(guò)度表達(dá)是降低生存率的預(yù)后因素，與NR4A1依賴性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)信號(hào)有關(guān)。NR4A1高表達(dá)的NSCLC患者OS和PFS較短[14]。我們?cè)趯?duì)NR4A1這個(gè)基因預(yù)后情況展開(kāi)了解的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，NR4A1低表達(dá)時(shí)KICH、KIRC總體預(yù)后不良，而在STAD中NR4A1高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致生存期下降。可能因?yàn)镺S、DFS終點(diǎn)結(jié)局以及觀察時(shí)間存在差異，導(dǎo)致NR4A1低表達(dá)在THCA預(yù)后分析中出現(xiàn)相反結(jié)果。目前尚需要更多高質(zhì)量臨床試驗(yàn)，為探尋NR4A1與THCA預(yù)后關(guān)系提供更有利的證據(jù)。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，不管NR4A1基因改變與否并不存在生存差異。以C4型鋅指結(jié)構(gòu)上位點(diǎn)X292為例，發(fā)生拼接突變后LUAD患者OS、PFS、DFS、DSS無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。究其原因，可能因?yàn)镹R4A1基因改變病例數(shù)過(guò)少，需要更大的病例數(shù)，以確定NR4A1基因改變是否增加預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。

成纖維細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中一類主要的非造血基質(zhì)細(xì)胞類型[15]，與浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞在腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展和耐藥性中起著重要作用[16]。腫瘤轉(zhuǎn)移涉及腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間的復(fù)雜相互作用[17]，而活化的CAFs數(shù)量的增加與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化不良密切相關(guān)[18]。NR4A1在絕大多數(shù)腫瘤中的表達(dá)水平與CAFs浸潤(rùn)呈顯著正相關(guān)，僅在TGCT中NR4A1表達(dá)與CAFs浸潤(rùn)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。這表明NR4A1與CAFs浸潤(rùn)之間的相關(guān)性是癌癥依賴性的，腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生在晚期癌癥階段，CAFs介導(dǎo)的浸潤(rùn)加深，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)“劫持”NR4A1用來(lái)保護(hù)腫瘤細(xì)胞。

NR4A1基因參與MAPK信號(hào)通路[19]。課題組前期通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩方面論證NR4A1通過(guò)抑制 NF-κB和 p38 MAPK 信號(hào)通路在 LPS 誘導(dǎo) ARDS 中下調(diào) ET-1 表達(dá)[20]。KEGG、GO分析顯示NR4A1及相關(guān)基因在胞核內(nèi)外都有表達(dá)，與NR4A1蛋白出核在細(xì)胞質(zhì)中行使生物學(xué)功能相一致。當(dāng)NR4A1轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)，與Bcl-2形成促凋亡復(fù)合物對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的刺激做出響應(yīng)[2]。與甲狀腺激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑富集程度顯示出NR4A1可能調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因，介導(dǎo)促甲狀腺素釋放激素誘導(dǎo)的促甲狀腺素β基因轉(zhuǎn)錄[21]。

綜上所述，通過(guò)對(duì)NR4A1的泛癌分析表明，NR4A1在癌癥中廣泛低表達(dá)，與蛋白磷酸化、CAFs浸潤(rùn)之間存在統(tǒng)計(jì)相關(guān)性，這有助于從臨床腫瘤樣本的角度來(lái)理解NR4A1在腫瘤發(fā)生中的作用。但與臨床預(yù)后、基因改變有待進(jìn)一步論證。