黎嬌凌， 陳 菊， 李玉紅

(黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院， 貴州 都勻 558000)

菝葜(SmilaxchinaL.)又名金剛藤，金剛果，鐵菱角，為菝葜科(Smila caceae)菝葜屬(SmilaxL.)攀援灌木。菝葜為常用中藥材，以根莖入藥、具有祛風(fēng)濕、利小便、消腫毒的功效，用于治療外科急性感染(癤、癰、蜂窩組織炎)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、癌腫等[1]。被廣泛用于治療婦科疾患、關(guān)節(jié)疼痛、肌肉麻木、痢疾、水腫、淋病、疔瘡、腫毒、痔瘡等癥[2]。應(yīng)用菝葜研制的金剛藤糖漿和金剛藤膠囊是我國治療婦科病的品牌良藥[3-4]。此外，菝葜的果色紅艷，嫩芽鮮紅(可食用)，樹形優(yōu)美，葉形奇特，耐寒性強(qiáng)等，可用于攀附巖石、 假山，也可作地面覆蓋，是一種良好的觀賞植物，可以作為南方地區(qū)立體綠化樹種[5]。張晨曦[6]研究表明，菝葜葉提取物有較強(qiáng)的抑菌作用，為增加菝葜的應(yīng)用價值提供了理論依據(jù)。菝葜主要靠自然分蘗或?qū)嵣敝?，但分蘗能力及種子發(fā)芽率低，扦插和嫁接較難成活[7]，且其藥用部位為其繁殖部位根莖。因野生資源破壞嚴(yán)重，為了更好地開發(fā)利用這一野生資源，有不少研究者對菝葜開展了研究，大多數(shù)研究集中在菝葜的種質(zhì)資源調(diào)查、化學(xué)成分、主要成分的提取及分析方法和藥理作用[8-9]，僅有少數(shù)幾個研究了菝葜的組織培養(yǎng)技術(shù)[10-11]，但繁殖率較低。為了優(yōu)化菝葜的組織培養(yǎng)技術(shù)體系，提高菝葜組織培養(yǎng)效率，本實(shí)驗(yàn)通過不同方法研究菝葜叢生芽的誘導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

以采自都勻斗篷山野生菝葜的幼嫩莖段和帶芽根狀莖為實(shí)驗(yàn)材料。

1.1.2試 劑

MS培養(yǎng)基(不含瓊脂和蔗糖)、瓊脂粉均為化學(xué)純，購于青島海博技術(shù)有限公司；蔗糖為西隴牌分析純試劑；6-BA，IBA，NAA均購于上海藍(lán)秀生物科技公司生產(chǎn)的規(guī)格為1 g，BR級試劑。

1.2 方 法

1.2.1不同消毒方法

外植體采用菝葜當(dāng)年生枝條，經(jīng)預(yù)處理后切成約2 cm長帶芽節(jié)段置超凈工作臺上用75%的酒精浸泡30 s、45 s后分別在0.1%的升汞溶液中浸泡3 min、5 min、7 min和9 min。然后用無菌水沖洗5次，每次1 min。最后去除外植體基部被消毒劑浸泡的部位，并留取約1.5 cm接種于培養(yǎng)基中。

1.2.2不同激素配比

采用當(dāng)年生帶芽莖段、莖尖及帶芽根狀莖，預(yù)處理后在75%的酒精中浸泡30 s，在0.1%的升汞水溶液中浸泡7 min。然后用無菌水沖洗5次(每次1 min)后，無菌接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以MS為基本培養(yǎng)基，并添加不同濃度的6-BA、NAA和IBA(具體濃度處理見表2)。蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH值5.8。

1.2.3不同外植體

采用當(dāng)年生帶芽莖段、莖尖及帶芽根狀莖，預(yù)處理后在75%的酒精中浸泡30 s，在0.1%的升汞水溶液中浸泡7 min。然后用無菌水沖洗5次(每次1 min)后，無菌接種于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)培養(yǎng)基中。

1.2.4不同防褐化處理

外植體在預(yù)處理之后，分別在抗壞血酸(0.5 g·L-1)、PVP(2 g·L-1)、半胱氨酸(0.1 g·L-1)中浸泡20 min，以不浸泡為對照處理。在75%的酒精中浸泡30 s，在0.1%的升汞水溶液中浸泡7 min。然后用無菌水沖洗5次(每次1 min)后，無菌紙吸干水分后接種于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)培養(yǎng)基中。

1.2.5不同季節(jié)、時期取材

分別在春、夏、秋季取當(dāng)年生枝條，枝條經(jīng)預(yù)處理后切成約2 cm長帶芽節(jié)段，用PVP(2 g·L-1)浸泡20 min后于超凈工作臺上用75%酒精短時浸泡30 s，然后用0.1%升汞溶液處理7 min，用無菌水沖洗5次，每次1 min。去除外植體基部被消毒劑浸泡的部位并留取約1.5 cm接種于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)培養(yǎng)基上。

所有處理經(jīng)洗衣粉水浸泡5 min，流水下沖洗2 h后，每處理按10個芽，重復(fù)3次，于(25±2)℃，光照強(qiáng)度1 500～3 000 lx，每天光照12 h。培養(yǎng)第15天、第25天各記錄一次，第30天后統(tǒng)計誘導(dǎo)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間對外植體污染率的影響

不同消毒劑和消毒時間對外植體的影響較大。正確選擇消毒劑的濃度和處理時間可以降低污染率，盡量減少組織死亡，提高外植體的萌發(fā)率。具體結(jié)果見表1。

表1 不同消毒處理對菝葜叢生芽誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of different disinfection treatments on the induction of cluster buds of S. china

從表1可以看出，處理4的污染率最低，并與處理1、2、6差異顯著，且芽的萌發(fā)率也最低，與其他5個處理均達(dá)顯著差異；而處理2、3、5的污染率也很低，綜合3種處理的萌發(fā)率可知，處理2的萌發(fā)率最高，并與處理3、5達(dá)顯著差異。因此，菝葜帶芽莖段最佳消毒方式是75%酒精浸泡30 s，然后用0.1%升汞溶液處理7 min。

2.2 不同激素配比對叢生芽誘導(dǎo)的影響

在MS基本培養(yǎng)基上，選用6-BA、NAA和IBA共3種植物激素，9種組合處理。 3種不同激素配比培養(yǎng)基對菝葜的誘導(dǎo)影響結(jié)果見表2。從表2可以看出，發(fā)芽率最高的分別是處理5、6、8，與其他處理均達(dá)到顯著差異。其中處理8的發(fā)芽率最高，但是芽扭曲畸形，而處理5的芽較處理6長勢好，綜合比較處理5對菝葜的叢生芽誘導(dǎo)效果最好。因此,菝葜叢生芽誘導(dǎo)的最佳配方為MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)。

表2 不同激素配比對叢生芽誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different hormone ratios on the induction of cluster buds of S. china

2.3 不同外植體叢生芽誘導(dǎo)

同一種植物不同部位外植體的叢生芽萌發(fā)能力不一樣，通過不同外植體實(shí)驗(yàn)研究最適合的外植體，具體結(jié)果見表3。

接種后的第15天統(tǒng)計結(jié)果顯示，莖尖芽萌發(fā)的速度最快，莖段芽萌發(fā)的速度稍慢而根狀莖最慢。第30天后的結(jié)果(表3)顯示，帶芽莖段、莖尖都能有效誘導(dǎo)叢生芽，兩者無顯著差異，且叢生芽生長情況較好，其中莖尖的萌發(fā)率最高，但是帶芽莖段最易獲得，且萌發(fā)的芽全部發(fā)育成叢生芽；莖尖一個枝條只有一個而且并不是所有的芽全部發(fā)育為叢生芽；根狀莖前期易褐化而影響萌發(fā)，因此發(fā)芽率很低，與莖段和莖尖的萌發(fā)率差異顯著，芽萌發(fā)后長勢也一般且材料不易獲得。綜上，菝葜叢生芽誘導(dǎo)的最佳外植體是帶芽莖段。

表3 不同外植體叢生芽誘導(dǎo)比較Table 3 Comparison of multiple shoots induction from different explants

2.4 幾種防褐化處理對外植體褐變的影響

菝葜外植體接種后易褐化，影響萌發(fā)甚至導(dǎo)致死亡，用3種不同防褐化劑處理后結(jié)果見表4。從表4可以看出，3種處理的褐化率都低于對照并達(dá)到顯著水平，對降低外植體的褐變率有明顯的作用。其中以PVP(2 g·L-1)浸泡的效果較為明顯，褐變率最低且與其他處理均達(dá)到顯著差異。

表4 不同外植體預(yù)處理防褐化比較Table 4 Pretreatment comparasion of different explants against browning

2.5 不同季節(jié)取材對萌發(fā)率和污染率的影響

在菝葜新生枝條的春季和生長旺盛季節(jié)的夏、秋季取外植體，結(jié)果表明，春季取材的外植體叢生芽的萌發(fā)率最高，污染率最低，且達(dá)到顯著差異。因此，最佳的取材季節(jié)為春季。具體見表5。

表5 不同季節(jié)取材處理Table 5 Comparison of sampling and treatment in different seasons

3 討論與結(jié)論

菝葜的外植體相對比較光滑，因此在外植體的預(yù)處理和消毒滅菌中，采用比較常規(guī)的方式就能取得很好的效果。

菝葜根狀莖含有較多的多酚化合物，在培養(yǎng)過程中較易褐化影響其萌發(fā)率。而且根狀莖是菝葜藥用的主要部位，因此不建議作為組培快繁的外植體。菝葜幼嫩莖段在組培中也同樣容易褐化，從而影響其萌發(fā)率。采取一些防褐化處理能大大降低其褐化率從而提高外植體的成活率。

植物內(nèi)源激素的調(diào)控是叢生芽成功誘導(dǎo)的重要因素。外植體組織中內(nèi)源激素水平不同，引起培養(yǎng)基中最適外源生長物質(zhì)濃度的變化[11]。因此，不同植物的組織培養(yǎng)有不同生長物質(zhì)種類及濃度的需要。在菝葜叢生芽誘導(dǎo)試驗(yàn)中，適當(dāng)?shù)姆至阉睾蜕L素濃度對菝葜叢生芽的分化有很大的影響。配比過低不利于叢生芽的誘導(dǎo)萌發(fā)，配比過高則會導(dǎo)致叢生芽產(chǎn)生畸形影響其生長，這與梁崇等[12]研究同屬植物土茯苓的結(jié)果一致。生長素NAA對于叢生芽的誘導(dǎo)效果要優(yōu)于IBA。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分裂素只用了一種，兩種細(xì)胞分裂素共同作用是否更有利于菝葜叢生芽的誘導(dǎo)有待進(jìn)一步研究。

圖1 菝葜叢生芽培養(yǎng)過程Fig.1 Cultivation proces of multiple shoots of S. china

在菝葜生長最為旺盛的夏、秋兩季，夏季由于溫度較高，其他有害微生物的繁殖速度也較快，因此容易污染從而影響發(fā)芽率；秋季可能由于其體內(nèi)的有效物質(zhì)積累到了較高水平，因此酚類物質(zhì)的含量也較多，外植體易褐化從而影響其成活率。

本研究表明，菝葜叢生芽誘導(dǎo)的最佳方法為：以菝葜帶芽莖段為外植體、用洗衣粉水浸泡5 min，流水下沖洗2 h后用PVP(2 g·L-1)浸泡20 min，然后于超凈工作臺上用75%酒精浸泡30 s，0.1%升汞處理7 min后無菌水清洗5次。接種于MS+6-BA(2 mg·L-1)+NAA(0.1 mg·L-1)+蔗糖30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1培養(yǎng)基中。于光照強(qiáng)度1 500～3 000 lx(每天光照12 h)，25 ℃下培養(yǎng)。