高子為， 朱有成， 劉雅婧， 楊旭光， 馬志鵬， 張?chǎng)紊?劉宇淇，陳彥文， 王慶鈺， 閆 帆， 李景文

(吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院， 長(zhǎng)春 130062)

鹽脅迫是制約植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要非生物脅迫之一，在鹽脅迫條件下，植物生長(zhǎng)狀況、發(fā)芽情況和產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響，許多鹽敏感植株無法生長(zhǎng)或產(chǎn)量明顯下降[1]。目前，我國(guó)有鹽漬化土壤近1億hm2，且數(shù)值仍在上升[2]。因此，對(duì)抗鹽植物的篩選和利用研究對(duì)鹽漬土壤的改良和利用具有重要意義。

植物在不同生長(zhǎng)階段對(duì)于不良環(huán)境的耐受性以及適應(yīng)性不同[3]，種子萌發(fā)期和幼苗期是植物對(duì)于鹽脅迫最敏感的時(shí)期。袁伊?xí)F等[4]研究表明，0.9%NaCl為豆科植物最適的耐鹽性鑒定指標(biāo)。苦豆子(Sophoraalopecuroides)作為豆科植物中耐鹽性較強(qiáng)的植物，生長(zhǎng)環(huán)境多為干旱及荒漠地區(qū)，抗鹽堿性和抗旱性強(qiáng)[5]，不同種屬植物的生長(zhǎng)環(huán)境具有較大差異，造成不同植物之間耐鹽性差異巨大[6-7]。大豆W 82作為豆科植物中研究較多的大豆品種，其抗鹽性屬于中等水平。另外，苦豆子還作為一種藥用植物，其中很多生物堿可被提取出來用于疾病治療，還可用作農(nóng)藥防治病蟲害，且苦豆子根系發(fā)達(dá)，在干旱荒漠地區(qū)作為防風(fēng)固沙植物被廣泛種植，防止水土流失[8]。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證苦豆子的耐鹽性，探究苦豆子和大豆2個(gè)種屬之間的耐鹽性差異，以不同濃度鹽溶液處理苦豆子和大豆種子及幼苗，通過發(fā)芽臨界濃度以及生理指標(biāo)檢測(cè)，進(jìn)行耐鹽性鑒定、評(píng)價(jià)，為植物耐鹽性研究以及苦豆子耐鹽性基因的進(jìn)一步利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料選用我國(guó)新疆庫(kù)爾勒苦豆子和中等抗鹽水平的大豆品種W 82(Williams 82)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)置鹽脅迫(0、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%NaCl)5個(gè)濃度處理，每個(gè)處理3次重復(fù)?？喽棺臃N子在實(shí)驗(yàn)前用98%濃硫酸處理10 min，無菌蒸餾水沖洗6～7次后無菌蒸餾水浸泡8～12 h，大豆W 82種子用氯氣滅菌處理。選取顆粒飽滿、大小均勻的種子，將種子放置在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿30粒種子加3 mL處理溶液，大豆W 82每皿20粒種子，加5 mL處理溶液，每24 h各培養(yǎng)皿等量補(bǔ)充處理溶液，報(bào)紙和黑布進(jìn)行遮光處理，置于恒溫氣候室中。實(shí)驗(yàn)開始后每天記錄種子發(fā)芽數(shù)(胚根長(zhǎng)度大于種長(zhǎng)為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn))，連續(xù)3 d無種子發(fā)芽時(shí)結(jié)束試驗(yàn)。

鹽脅迫對(duì)幼苗影響實(shí)驗(yàn)采用水培法，4周齡的苦豆子幼苗和大豆W 82幼苗，用蒸餾水輕輕刷洗干凈后分別移入配置好的不同鹽濃度(1/8×Hoagland和1.0×Hoagland)的營(yíng)養(yǎng)液中，每日觀察幼苗狀態(tài)，拍照記錄。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

發(fā)芽率(%)=(最終發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=(發(fā)芽脅迫實(shí)驗(yàn)第3天正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

CAT活性=[ΔA×V反總/(ε×d)×109]/(W×V樣/V樣總)/T；

POD活性=[ΔA×V反總/(W×V樣/V樣總)]/0.01/T；

SOD活性=[抑制百分率/(1-抑制百分率)×V反總]/(W×V樣/V樣總)×F。

式中：ΔA為吸光度差值；W為樣本鮮重；V反總為反應(yīng)體系總體積；ε為H2O2摩爾吸光系數(shù)；d為比色皿光徑；V樣為加入樣本體積；V樣總為加入提取液體積；T為反應(yīng)時(shí)間。

苦豆子和大豆胚根用常量生化試劑盒(購(gòu)自索萊寶科技有限公司)進(jìn)行POD、CAT、SOD活性檢測(cè)。

1.4 耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

以不同鹽濃度脅迫下的相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)為耐鹽指標(biāo)，根據(jù)隸屬函數(shù)值大小綜合評(píng)價(jià)苦豆子和大豆種子的耐鹽性，比較兩個(gè)物種間耐鹽性差異[9]。

隸屬函數(shù)公式：

X(μ)=(X測(cè)-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中：X測(cè)為測(cè)量值，Xmin為測(cè)量值中最小值，Xmax為測(cè)量值中最大值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，Excel軟件作圖，各處理間的多因素方差分析以及各處理的單因素方差分析用SPSS軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鹽溶液對(duì)苦豆子和大豆種子發(fā)芽率的影響

不同濃度的鹽溶液對(duì)苦豆子和大豆W 82種子發(fā)芽率影響具有顯著性差異(表2)。不同時(shí)間段鹽溶液處理下的苦豆子和大豆種子發(fā)芽率對(duì)比發(fā)現(xiàn)，苦豆子和大豆發(fā)芽率有同樣變化趨勢(shì)，在0.9%鹽溶液濃度下苦豆子發(fā)芽率為94.52%，大豆W 82種子發(fā)芽率為41.67%，在1.2%鹽溶液濃度下苦豆子發(fā)芽率為68.83%，大豆發(fā)芽率為22.50%(圖1)，鹽溶液濃度提高了200 mmol·L-1，苦豆子發(fā)芽率下降了29.09%，大豆W 82發(fā)芽率下降了77.5%，大豆種子發(fā)芽率下降趨勢(shì)更加明顯，表明苦豆子種子發(fā)芽階段耐鹽性強(qiáng)于大豆種子(圖1、表1)[10-11]。

表1 鹽脅迫下苦豆子和大豆種子發(fā)芽率Table 1 Comparison of germination index between S. alopecuroides and soybean under salt stress

表2 鹽脅迫下大豆、苦豆子種子發(fā)芽率差異分析Table 2 Variance analysis of seed germination rate of soybean and S. alopecuroides under salt stress

圖1 不同鹽濃度梯度下苦豆子和大豆種子平均發(fā)芽率對(duì)比Fig.1 Comparison of average seed germination rate between S. alopecuroides and soybean under different salt concentration gradients

2.2 不同濃度鹽溶液對(duì)苦豆子和大豆種子發(fā)芽勢(shì)的影響

鹽溶液處理3 d后(圖2)，苦豆子和大豆W 82種子在蒸餾水中發(fā)芽勢(shì)均接近1，隨著鹽溶液濃度逐漸提高，苦豆子和大豆的發(fā)芽勢(shì)逐漸下降，差值逐漸增大，證明苦豆子抗鹽性明顯優(yōu)于大豆W 82[12-13]。

圖2 不同鹽溶液濃度梯度下大豆和苦豆子種子發(fā)芽勢(shì)對(duì)比Fig.2 Comparison of seed germination potential between S. alopecuroides and soybean under different salt concentration gradients

2.3 不同濃度鹽溶液對(duì)苦豆子和大豆種子芽期生理指標(biāo)的影響

在植物體中H2O2有雙重作用，H2O2在植物體內(nèi)抗脅迫進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，適量的H2O2作為脅迫信號(hào),通過誘導(dǎo)一系列防御機(jī)制來保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化脅迫，但過量的H2O2導(dǎo)致過氧化損傷，因此植物體內(nèi)進(jìn)化出相應(yīng)的抗氧化機(jī)制，SOD、CAT和POD是抗氧化機(jī)制中較為重要的3種酶[14-20]。

過氧化氫酶(CAT)在抗氧化機(jī)制中通過催化過量的H2O2分解形成H2O，減少植物體內(nèi)H2O2活性，減輕氧化傷害。隨著鹽溶液濃度的升高，鹽脅迫越來越強(qiáng)，苦豆子和大豆W 82通過增加H2O2活性來抵御鹽脅迫環(huán)境。但低濃度鹽脅迫條件下苦豆子生長(zhǎng)不受影響，CAT活性下降，而隨著鹽脅迫濃度上升，可能苦豆子中存在其他抗鹽機(jī)制，CAT活性持續(xù)下降且低于對(duì)照(圖3)；低濃度鹽脅迫下大豆W 82生長(zhǎng)受到影響，產(chǎn)生H2O2抵御鹽脅迫，CAT活性上升，而高濃度下大豆W 82中CAT活性下降且明顯低于對(duì)照(圖3，表3)，可能是大豆在高濃度鹽溶液中受到嚴(yán)重傷害[21-22]。

表3 不同濃度鹽溶液處理中苦豆子種子CAT活性差異分析Table 3 Variance analysis of CAT activities of S. alopecuroides under salt solution with different concentrations

圖3 不同濃度鹽溶液處理中苦豆子根的過氧化氫酶活性Fig.3 Comparison of CAT activities between S. alopecuroidesand soybean roots under different salt concentration gradients

在抗逆過程中，POD也起著至關(guān)重要的作用，POD作用底物是H2O2以及有機(jī)過氧化物等，通過促進(jìn)H2O2的反應(yīng)，減少H2O2的積累，防止H2O2帶來的過氧化效應(yīng)對(duì)植物造成傷害。在抗逆過程中POD同時(shí)參與植物組織構(gòu)建，將組織中的碳水化合物轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素，使植物體的木質(zhì)化程度增加，減少外界鹽離子進(jìn)入，進(jìn)而提高植物抵抗外界壓力的能力。

不同濃度鹽溶液處理后，經(jīng)試劑盒檢測(cè)和紫外分光光度計(jì)測(cè)量吸光度，最終數(shù)據(jù)分析得到不同濃度梯度下苦豆子和大豆W 82胚根中POD活性和趨勢(shì)圖(圖4)，鹽溶液低濃度條件下，苦豆子中POD活性下降，且隨著鹽溶液濃度上升，苦豆子中POD活性逐漸增加。各濃度梯度處理下POD活性之間有顯著差異(表4)，證明POD在苦豆子抵抗外界鹽脅迫過程中起著重要作用[23-24]。

圖4 不同濃度鹽溶液處理下苦豆子和大豆W 82種子過氧化物酶活性Fig.4 Comparison of POD activities between S. alopecuroides and soybean W 82 under different salt concentration gradients

表4 不同濃度鹽溶液處理下苦豆子種子POD活性差異分析Table 4 Variation analysis of POD activities of S. alopecuroides seeds under different concentrations of salt solution

低濃度鹽脅迫條件下，苦豆子生長(zhǎng)受到鹽脅迫影響小，SOD活性下降，在高濃度鹽脅迫條件下，可能存在其他抗鹽機(jī)制，苦豆子SOD活性持續(xù)下降，最終低于對(duì)照；低濃度鹽脅迫下大豆W 82生長(zhǎng)受到影響，為了響應(yīng)鹽脅迫環(huán)境，SOD活性上升，但高濃度下大豆W 82中SOD活性下降且明顯低于對(duì)照(圖5)，可能是大豆W 82種子受到嚴(yán)重傷害。不同濃度鹽處理?xiàng)l件下苦豆子和大豆W 82種子中SOD活性差異顯著(表5)[25]。

表5 不同濃度鹽溶液處理下苦豆子種子SOD活性差異分析Table 5 Variation analysis of SOD activities of S. alopecuroides seeds under different concentrations of salt solution

圖5 不同濃度鹽溶液處理下苦豆子種子SOD活性Fig.5 Comparasion of SOD activities of S. alopecuroides seeds under different concentrations of salt solution

2.4 不同濃度鹽溶液對(duì)苦豆子和大豆幼苗期的影響

選取4周齡苦豆子和大豆W 82幼苗進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn)，將幼苗移栽至不同濃度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，以此探究苦豆子和大豆幼苗能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)的最適濃度。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，最終確定苦豆子幼苗在1/8×Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)狀況最為穩(wěn)定，大豆幼苗在1.0×Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)狀況穩(wěn)定。

24 h處理下苦豆子幼苗和大豆W 82幼苗均可以正常生長(zhǎng)，低濃度下大豆W 82幼苗和苦豆子幼苗之間并無明顯差異，但高濃度鹽脅迫下的大豆W 82幼苗已經(jīng)出現(xiàn)發(fā)黃現(xiàn)象(圖6)，同期處理下苦豆子幼苗雖然出現(xiàn)萎蔫情況，但生長(zhǎng)狀況并未受到明顯影響(圖7)，長(zhǎng)勢(shì)良好。

圖6 24 h內(nèi)不同濃度鹽溶液處理下大豆幼苗生長(zhǎng)狀況Fig.6 Comparison of growth status of soybean seedlings treated with different concentrations of salt within 24 h

圖7 24 h內(nèi)不同濃度鹽溶液處理下苦豆子幼苗生長(zhǎng)狀況Fig.7 Comparison of growth status of S. alopecuroides seedlings treated with different concentrations of salt within 24 h

72 h鹽溶液處理下的苦豆子和大豆W 82幼苗均開始出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，鹽溶液濃度高于0.9%處理下的大豆幼苗開始死亡，0.6%濃度鹽溶液處理下的大豆W 82幼苗也開始出現(xiàn)發(fā)黃干枯現(xiàn)象(圖8)；大豆W 82根系生長(zhǎng)受到鹽溶液影響，根系生長(zhǎng)狀況差；苦豆子在高濃度鹽溶液處理下，也開始出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，長(zhǎng)勢(shì)受阻，但萎蔫程度遠(yuǎn)低于大豆，大于0.9%鹽溶液處理下仍能夠生長(zhǎng)，根系生長(zhǎng)狀況良好，不造成死亡現(xiàn)象(圖9)。實(shí)驗(yàn)探究得到苦豆子在營(yíng)養(yǎng)液中鹽處理臨界濃度為1.2%，高于大豆的臨界濃度(0.9%)[26-27]。

圖8 不同濃度鹽脅迫72 h大豆幼苗生長(zhǎng)狀況Fig.8 Comparison of growth status of soybean seedlings under different concentration of salt stress for 72 h

圖9 72 h不同濃度鹽脅迫下苦豆子幼苗生長(zhǎng)狀況Fig.9 Comparison of growth status of S. alopecuroides seedlings under different concentration of salt stress for 72 h

表6 苦豆子和大豆W 82幼苗生長(zhǎng)狀況Table 6 Statistics of growing status of S. alopecuroides and soybean W 82

鹽溶液處理下的大豆和苦豆子幼苗生長(zhǎng)狀況隨時(shí)間和鹽溶液濃度而改變，24 h處理下苦豆子和大豆W 82幼苗都能夠正常生長(zhǎng)，并未表現(xiàn)出顯著差異。但在72 h處理下，苦豆子幼苗和大豆W 82幼苗抗鹽性存在差異，同濃度鹽溶液處理下苦豆子幼苗生長(zhǎng)狀況明顯好于大豆W 82幼苗。結(jié)果表明，苦豆子幼苗耐鹽性強(qiáng)，苦豆子幼苗的抗鹽能力遠(yuǎn)高于大豆W 82幼苗。

2.5 苦豆子和大豆W 82萌發(fā)期和幼苗期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

根據(jù)不同濃度鹽脅迫下的苦豆子和大豆W 82種子的平均發(fā)芽率、平均發(fā)芽勢(shì)對(duì)苦豆子和大豆W 82種子的耐鹽性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析，結(jié)果表明，苦豆子種子抗鹽性強(qiáng)于大豆W 82種子；以不同濃度鹽溶液中苦豆子和大豆幼苗生長(zhǎng)狀況為指標(biāo)對(duì)苦豆子和大豆W 82幼苗的耐鹽性進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明，苦豆子幼苗抗鹽性強(qiáng)于大豆W 82幼苗。

3 討 論

3.1 高濃度鹽脅迫對(duì)苦豆子和大豆發(fā)芽率的影響

鹽脅迫是影響種子發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)的一種主要非生物脅迫，在鹽脅迫條件下種子發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)均會(huì)受到一定程度的影響。鹽脅迫最初通過滲透壓調(diào)節(jié)造成植物體失水，隨著時(shí)間增加，鹽脅迫危害方式轉(zhuǎn)變成離子毒害。發(fā)芽臨界濃度是衡量植物耐鹽性的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦豆子發(fā)芽臨界濃度為1.2%，高于大豆W 82種子發(fā)芽臨界濃度(0.9%)。臨界濃度的不同可能與植物的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，新疆庫(kù)爾勒苦豆子生長(zhǎng)在鹽堿、干旱地區(qū)，而大豆W 82生長(zhǎng)在正常環(huán)境條件下，這可能是苦豆子耐鹽性強(qiáng)于大豆W 82的原因之一[28]。

今后應(yīng)改變苦豆子的生長(zhǎng)環(huán)境，將庫(kù)爾勒苦豆子栽種到正常環(huán)境下，每年觀察苦豆子的臨界發(fā)芽濃度是否改變，以此探究苦豆子的耐鹽性是否與生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)；研究苦豆子的耐鹽機(jī)理，確定苦豆子中耐鹽基因，為改良大豆耐鹽性提供一定的參考依據(jù)。

3.2 高濃度鹽脅迫對(duì)苦豆子抗氧化酶活性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下苦豆子抗氧化酶活性發(fā)生變化，其中CAT、SOD活性持續(xù)下降，POD活性先下降后上升，且低于對(duì)照。Pramod等[29]研究表明，肉桂酸誘導(dǎo)了玉米中CAT活性下降，POD活性上升，本實(shí)驗(yàn)得到的抗氧化酶變化趨勢(shì)總體與玉米中抗氧化酶活性變化趨勢(shì)相同，玉米中抗氧化酶受肉桂酸調(diào)控，所以苦豆子中抗氧化酶活性變化可能與肉桂酸活性有關(guān)，但仍需進(jìn)一步探究。宋苗苗[30]研究表明，紫花苜蓿在鹽溶液處理下CAT活性下降；段才緒等[31]研究表明，決明種子在鹽脅迫條件下CAT、SOD活性下降且低于對(duì)照。鹽脅迫下苦豆子中CAT、SOD活性變化趨勢(shì)與決明和紫花苜蓿趨勢(shì)相似，但在低濃度鹽溶液下決明種子的CAT、SOD活性上升，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之不同，可能是物種間耐鹽機(jī)理不同造成的差異。

4 結(jié)論與展望

苦豆子種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)臨界濃度均為1.2%，胚根的SOD、 CAT活性持續(xù)下降，POD活性先下降后上升，但高濃度下POD活性仍低于對(duì)照。

大豆W 82種子發(fā)芽臨界濃度為0.6%，幼苗生長(zhǎng)臨界濃度為0.9%，胚根的POD、CAT、SOD活性均先上升后下降且低于對(duì)照。

苦豆子的抗氧化酶活性變化趨勢(shì)相較于大豆更加平穩(wěn)，可能與二者抗鹽性不同有關(guān)，低濃度下苦豆子受鹽脅迫影響小，抗氧化酶含量下降，而大豆W 82抗氧化酶活性上升，是因?yàn)榈蜐舛认麓蠖筗 82受到鹽脅迫影響。發(fā)芽率和抗氧化酶活性對(duì)比表明，苦豆子芽期的抗鹽性強(qiáng)于大豆W 82；幼苗期大豆W 82和苦豆子的表型分析表明，苦豆子幼苗期的抗鹽性也強(qiáng)于大豆W 82。

苦豆子和大豆同屬豆科，生理生化反應(yīng)類似，研究苦豆子芽期和苗期的耐鹽性對(duì)進(jìn)一步培育大豆耐鹽新品種具有一定的參考意義，并為研究大豆的抗逆機(jī)理，改變大豆的抗鹽性提供了一定的理論依據(jù)。