趙 塔， 王華磊， 李丹丹， 陳松樹， 李金玲， 羅春麗

(貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 貴陽 550025)

黨參(Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.)作為中國的一種傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，別名臭參、棱子黨參、古東根、土黨參[1]。2015年版《中國藥典》中規(guī)定其正品來源是桔梗科植物黨參[Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.]、素花黨參[C.pilosulaNannf.var.modesta(Nannf.) L.T.Shen]或川黨參(C.tangshenOliv.)的干燥根。黨參味甘，性平，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)中益氣、養(yǎng)血生津、健脾益肺的功效。在臨床上常用于食少倦怠、氣血不足、心悸氣短、內(nèi)熱消渴、脾肺氣虛、咳嗽虛喘、面色萎黃、津傷口渴等癥[2]。黨參主要含有糖類、苷類、萜類聚炔類及生物堿等化學(xué)成分，具有促進(jìn)造血機(jī)能、調(diào)節(jié)血糖、抗疲勞、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、延緩衰老、保護(hù)胃腸道黏膜及調(diào)節(jié)胃收縮等多種藥理作用[3]。黨參在臨床方面的應(yīng)用較為普遍, 一般用于治療心血管系統(tǒng)疾病、婦科疾病以及緩解應(yīng)激反應(yīng)造成的身體不適，還可作為輔助藥物提高西藥療效、降低不良反應(yīng)[4]，具有較高的研究價(jià)值和開發(fā)前景。

誘變技術(shù)是實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源創(chuàng)新的有效手段之一，其中化學(xué)誘變是指利用化學(xué)誘變試劑處理植物的組織器官，造成 DNA的缺失和修補(bǔ)，并借助基因突變或者基因重組引起有機(jī)體變異，從而創(chuàng)造新的種質(zhì)[5]。EMS誘變具有點(diǎn)突變多、誘變頻率高等優(yōu)點(diǎn)，是目前最為有效的植物化學(xué)誘變技術(shù)之一[6]。 白戈等[7]通過EMS誘導(dǎo)云煙87煙草，從中篩選根系發(fā)達(dá)的突變體植株，獲得了一份可穩(wěn)定遺傳的高煙堿KH 65突變體煙草材料。何佳越等[8]以多肉植物東云系Corderoyi 的花梗為外植體進(jìn)行不同濃度 EMS 浸泡處理，再誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，觀察表型變異，進(jìn)行突變體篩選，得到4類表型變異穩(wěn)定、具有觀賞價(jià)值的多肉植物突變體。張桂芳等[9]利用EMS溶液誘變處理廣金錢草種子，對M1和M2代進(jìn)行鑒定和篩選突變體，初步構(gòu)建了EMS誘變廣金錢草突變體庫。EMS誘變技術(shù)還廣泛應(yīng)用于小麥[10]、豇豆[11]、黃瓜[12]和苦蕎[13]等作物中。

目前，國內(nèi)對黨參的研究主要集中在化學(xué)成分、肥料以及藥用療效等方面，針對黨參優(yōu)良品種選育的相對較少。汪淑霞等[14]應(yīng)用重離子輻照生物育種技術(shù)輻射誘變渭黨1號，選育出黨參新品系“渭黨3號”；馬璐琳等[15]對黨參幼苗的上胚軸生長點(diǎn)和中胚軸分別進(jìn)行三種不同時間的誘變處理，獲得黨參的同源四倍體植株；而馬曉菲等[16]則以EMS 處理輪葉黨參的離體葉片和愈傷組織對其進(jìn)行誘變，選出具有較高皂苷含量的初選植株，并為無性系變異的方法增產(chǎn)輪葉黨參藥用成分提供了證據(jù)。

本試驗(yàn)用EMS誘變技術(shù)處理黨參種子，開展EMS不同濃度及誘變時間對黨參種子萌發(fā)影響的研究，確定黨參種子誘變的適宜濃度和處理時間，同時得出EMS的誘變對黨參種子萌發(fā)和黨參種子芽生長的影響趨勢，為開展黨參EMS突變育種提供重要參考依據(jù)，為創(chuàng)新黨參種質(zhì)資源以及選育黨參新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1試驗(yàn)材料

黨參(Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.)種子。

1.1.2EMS溶液的配置

稱取Na2HPO4·12 H2O 35.82 g，用ddH2O定容于1 000 mL容量瓶中，作為母液A；稱取NaH2PO4·2 H2O 15.61 g，用ddH2O定容于1 000 mL容量瓶中作為母液B。吸取610 mL母液A 與390 mL母液B 于1 000 mL容量瓶中混合，即得0.1 mol·L-1pH值7.0的磷酸緩沖溶液(PBS)，以該緩沖溶液作為溶劑，配置成不同濃度的EMS溶液(0，1%，2%，3%，4%，5%)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以黨參種子為材料，用不同濃度EMS(0，1%，2%，3%，4%，5%)處理黨參種子6 h、8 h、12 h和24 h，每個處理3個重復(fù)，共72個處理。

1.3 試驗(yàn)方法

用水清洗黨參種子，水選下層黨參種子，每個處理100粒，用無菌水浸泡6 h，用濾紙吸干種子表面水分，分別用不同濃度的EMS溶液浸種相對應(yīng)的時間后取出，EMS廢液用Na2S2O3溶液處理。將黨參種子用流水沖洗3 h，吸干種子表面水分，放置在已浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃ 黑暗條件培養(yǎng)。

1.4 測定指標(biāo)

每天觀察種子發(fā)芽情況，及時補(bǔ)充水分，并去除霉變感菌的種子。7 d計(jì)算發(fā)芽勢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束計(jì)算發(fā)芽率，測量黨參種子芽長。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

相對發(fā)芽率(%)=(處理萌發(fā)率/對照萌發(fā)率) ×100%；

發(fā)芽勢(%)=(7 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)) ×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件整理數(shù)據(jù)及制表，SPSS 22.0軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度EMS和誘變時間對黨參種子發(fā)芽率和相對發(fā)芽率的影響

由圖1及表1可知，同一處理時間下，隨著EMS濃度的升高，各處理的發(fā)芽率逐漸減小，相對發(fā)芽率逐漸下降，且EMS濃度在2%以上的各處理發(fā)芽率和相對發(fā)芽率都顯著小于對照組。8 h和12 h處理?xiàng)l件下，分別在EMS濃度為2%、3%時，發(fā)芽率降為0，而6 h處理EMS濃度為0的發(fā)芽率為43.33%，EMS濃度為5%發(fā)芽率下降到6.84%，降幅36.49%，相對發(fā)芽率降幅84.21%；24 h處理?xiàng)l件下EMS濃度為0的發(fā)芽率為43.00%，EMS濃度為5%的發(fā)芽率下降到2.41%，降幅40.59%，相對發(fā)芽率降幅94.40%。同一EMS濃度處理下，各處理的發(fā)芽率隨著誘變時間增加先減小再逐漸升高；各處理的相對發(fā)芽率(除了1% EMS)隨著誘變時間增加先逐漸降低再逐漸升高。1%～5% EMS濃度下，不同誘變時間對黨參種子發(fā)芽率有顯著差異。在3%～5%EMS濃度下，隨著誘變時間變化，發(fā)芽率隨著時間的增加而逐漸降低再逐漸升高。在1% EMS濃度下，不同誘變時間對黨參種子相對發(fā)芽率影響差異不顯著；在2%～5% EMS濃度下，不同誘變時間顯著影響黨參種子相對發(fā)芽率。

圖1 EMS 濃度與處理時間對黨參種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of combinations of EMS concentration and treatment time on germination rate of Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf. seeds

表1 EMS濃度與處理時間對黨參種子相對發(fā)芽率的影響

由此可見，發(fā)芽率和相對發(fā)芽率受誘變時間和EMS濃度的影響。其中EMS抑制黨參種子的發(fā)芽，隨著EMS濃度的升高，對黨參種子的發(fā)芽抑制作用越強(qiáng)，即高濃度EMS(3%～5%)對黨參種子發(fā)芽抑制作用比低濃度(1%～2%)對黨參種子發(fā)芽抑制作用強(qiáng)。但是，在同等濃度中，隨著抑制作用的增強(qiáng)，也僅有8 h和12 h處理時間下出現(xiàn)發(fā)芽率和相對發(fā)芽率為0的情況。

2.2 不同濃度EMS和誘變時間對黨參種子發(fā)芽勢的影響

由表2可得，同一處理時間下，各處理的發(fā)芽勢隨著EMS濃度的升高逐漸降低。6 h、12 h和24 h時間處理下，2%EMS濃度或更高濃度時的發(fā)芽勢均分別顯著低于ck，8 h處理時間下各處理的黨參種子的發(fā)芽勢都顯著低于ck。同一處理濃度下，各處理的發(fā)芽勢隨著誘變時間的增加逐漸降低再升高。隨著EMS濃度的升高，2%EMS濃度處理8 h，3%EMS濃度處理8 h和12 h，4%EMS濃度處理6 h、8 h、12 h和5%EMS濃度各處理時間的發(fā)芽勢均為0。發(fā)芽勢可體現(xiàn)黨參種子的發(fā)芽活力，誘變劑EMS可以降低黨參種子的活力，并抑制黨參種子的發(fā)芽。隨著EMS濃度的升高，EMS對黨參種子發(fā)芽活力降低的程度就越大，即抑制程度隨EMS的劑量增加而增大，直至5% EMS濃度各處理時間的發(fā)芽勢都為0。

表2 EMS 濃度與處理時間對黨參種子發(fā)芽勢的影響

2.3 不同濃度EMS和誘變時間對黨參種子發(fā)芽進(jìn)程的影響

同一EMS濃度下，發(fā)芽起始時間、發(fā)芽持續(xù)時間和發(fā)芽時間顯著受到誘變時間的影響。同一誘變時間處理下，發(fā)芽起始時間、發(fā)芽持續(xù)時間和發(fā)芽時間顯著受到EMS濃度的影響(圖2)。隨著EMS濃度的升高，各處理的發(fā)芽起始時間逐漸增加，發(fā)芽持續(xù)時間逐漸減少，所需發(fā)芽時間也隨之延長。在8 h誘變處理中的3%～5%EMS和12 h誘變處理中的4%～5%EMS處理的黨參種子未發(fā)芽。本試驗(yàn)中，5% EMS處理黨參種子24 h所需發(fā)芽時間最長，需13.33 d才開始發(fā)芽，相對于ck，延長了12.33 d； 5%EMS處理黨參種子24 h的持續(xù)發(fā)芽時間最短，為1.00 d，相對于ck縮短了9.67 d；而發(fā)芽時間最長的是3%EMS處理黨參種子24 h，為14.67 d，相對于ck延長了3 d。

圖2 EMS 濃度與處理時間組合對黨參種子發(fā)芽進(jìn)程的影響 Fig.2 Effects of combinations of EMS concentration and treatment time on germination process of Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf. seeds

由此可得，在EMS濃度和誘變處理時間的作用下，隨著EMS濃度的增加，發(fā)芽起始時間延長，發(fā)芽持續(xù)時間減少，發(fā)芽時間延長，說明EMS會抑制黨參種子的發(fā)芽，縮短黨參種子的發(fā)芽持續(xù)時間，延長了黨參種子的發(fā)芽進(jìn)程。

2.4 EMS濃度對黨參種子芽長的影響

同一處理濃度下(除0 EMS)，黨參種子的芽長隨著處理時間的增加呈先降低后增加的趨勢(圖3)。同一誘變處理時間下，不同EMS濃度對黨參種子的芽長有極顯著的抑制作用，隨著EMS濃度的升高，黨參種子的芽長逐漸降低，并且各處理的芽長都顯著低于ck。其中處理時間為6 h對黨參種子的芽長影響較小，相對于對照組EMS濃度對芽長抑制作用為60.87%，芽長由27.60 mm抑制為10.80 mm；處理時間為8 h，EMS濃度對黨參種子芽長抑制作用最強(qiáng)，在3% EMS的條件下高達(dá)100%；而處理時間為12 h，在4% EMS條件下對黨參種子芽長抑制作用為100%。

圖3 EMS 濃度對黨參種子芽長的影響Fig.3 Effects of EMS concentration on bud length of Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf. seeds

2.5 不同濃度EMS和誘變時間對黨參種子發(fā)芽率影響的方差分析

從表3可知，不同EMS濃度對黨參種子的發(fā)芽率和芽長存在極顯著影響(p<0.01)，不同處理時間對黨參種子發(fā)芽率和芽長也有極顯著影響，而且EMS濃度和處理時間的交互作用對黨參種子的發(fā)芽率及芽長也有極顯著的影響。EMS濃度、誘變時間以及EMS濃度和誘變時間的相互作用是影響黨參種子發(fā)芽率、芽長的主體因素，因此在對黨參種子進(jìn)行EMS 誘變時，必須綜合考慮 EMS 濃度和誘變時間對誘變效果的影響。

表3 不同濃度EMS和誘變時間對黨參種子發(fā)芽率、芽長影響的方差分析

3 結(jié) 論

用EMS對植物進(jìn)行誘變育種，選擇適宜誘變條件很關(guān)鍵。通過對黨參種子進(jìn)行不同EMS濃度和不同時間的化學(xué)誘變，發(fā)現(xiàn)EMS對黨參種子的發(fā)芽有明顯的抑制作用，在8 h、12 h和24 h處理?xiàng)l件下，隨著EMS濃度升高，各處理的相對發(fā)芽率未出現(xiàn)接近50%值，故沒有適宜的EMS誘變條件。而在6 h處理?xiàng)l件下，當(dāng)EMS濃度為4%時，發(fā)芽率為21.07%，相對發(fā)芽率為48.64%，接近半致死率，故黨參種子的最佳EMS誘變濃度和誘變時間分別為4%和6 h。

4 討 論

EMS會抑制種子的萌發(fā)。楊森等[17]研究表明，隨著EMS濃度增加，紫蘇種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均呈下降趨勢，即誘變劑EMS對紫蘇種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率可產(chǎn)生抑制作用。本研究利用不同濃度的EMS對黨參種子進(jìn)行誘變處理，發(fā)現(xiàn)EMS顯著抑制黨參種子的發(fā)芽，隨著EMS濃度升高，發(fā)芽率和發(fā)芽勢減小，并且發(fā)芽起始時間延長，發(fā)芽持續(xù)時間減少，發(fā)芽時間延長，即起始發(fā)芽時間和發(fā)芽時間與EMS濃度呈正相關(guān)，與發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽持續(xù)時間呈負(fù)相關(guān)，這與安佰義等[18]用EMS誘變白樺種子結(jié)論相似，但是不同之處是白樺種子的發(fā)芽時間隨著EMS濃度升高而降低。其原因有可能是EMS對不同植物種子有不同誘變效應(yīng)所致，降低黨參種子活力，使得黨參種子的起始發(fā)芽時間延長較長。EMS誘變對黨參種子起始發(fā)芽時間延長，持續(xù)發(fā)芽時間縮短，使得黨參種子發(fā)芽不整齊，說明EMS在一定程度上會抑制黨參種子的發(fā)芽進(jìn)程。

同一EMS濃度的條件下，在3% EMS處理黨參種子8 h時率先出現(xiàn)發(fā)芽率為0的情況，而3% EMS條件下的12 h和24 h的發(fā)芽率分別是9%和27.09%；4%、5% EMS條件下8 h和12 h的發(fā)芽率都為0，24 h的發(fā)芽率分別為10.19%和2.41%，其結(jié)果可能是浸泡時間過長導(dǎo)致。水分是影響種子萌發(fā)的重要因素之一，在種子細(xì)胞中的自由水增加到足夠才能使細(xì)胞呼吸作用和新陳代謝加快，酶被活化進(jìn)行反應(yīng)，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)[19-21]。在浸泡過程中，隨著EMS逐漸滲入黨參種子胚中，對黨參種子的發(fā)芽卻有抑制作用。在兩者的綜合作用下，水分對黨參種子發(fā)芽的促進(jìn)作用強(qiáng)于EMS對黨參種子發(fā)芽的抑制作用，導(dǎo)致黨參種子在3%～5% EMS濃度下誘變處理24 h還能發(fā)芽，具體原因還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前，EMS誘變技術(shù)是一項(xiàng)國內(nèi)外成熟的植物化學(xué)誘變技術(shù)，而EMS 作為構(gòu)建突變體育種的重要誘變試劑，誘變條件選擇最為關(guān)鍵[22]。EMS對種子的萌發(fā)有抑制作用，不同濃度的EMS和誘變處理時間對種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢有不同的影響，并且EMS對不同種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢的影響也不同，故而EMS處理不同材料的最佳濃度和最佳誘變時間也不同。例如楊楠等[23]以知母種子為材料，得出6% EMS 浸種 12 h 和 24 h為知母的最佳誘變濃度和時間；楊森等[17]以奇蘇3號紫蘇品種為材料進(jìn)行EMS誘變，得出1.25%濃度處理8 h是誘變紫蘇種子的最佳條件；楊玉雙等[24]以橡膠草品系CXCH 的種子為材料，對其進(jìn)行EMS化學(xué)誘變，最終確定0.30% 誘變處理12 h為橡膠草種子最適宜誘變條件。本試驗(yàn)研究中黨參種子的最佳EMS誘變濃度為4%、誘變時間為6 h。在EMS誘變中，EMS的濃度和誘變時間對植物材料的誘變效應(yīng)是疊加的，在進(jìn)行適合濃度和時間的篩選時，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行挑選。如胡志峰等[25]最終確定，0.9%EMS誘變處理6 h和0.7%EMS誘變處理9 h的組合為金花菜種子最佳誘變條件，在進(jìn)行誘變時就可考慮自身試驗(yàn)條件，對試驗(yàn)材料進(jìn)行高濃度的短時間處理或者低濃度的長時間處理。

通過對黨參種子不同EMS濃度的誘變研究，表明EMS誘變處理黨參種子對其種子芽長有明顯的抑制作用，這與伊風(fēng)艷等[26]的結(jié)果類似。而EMS濃度抑制了黨參種子的芽長，隨著濃度的升高，抑制作用越強(qiáng)，芽長逐漸變短，這與臧輝[27]對羊草種子的研究結(jié)果類似。在3% EMS條件下處理8 h和4% EMS條件下處理12 h黨參種子不發(fā)芽，這可能是由于誘變劑對于不同植物的誘變效應(yīng)不同造成的。