孔 嬌， 楊麗麗， 韓 雪， 常凡群， 牛敏敏， 吳明開， 夏 與， 唐傳照

(1.貴州大學生命科學學院， 貴陽 550025； 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院現(xiàn)代中藥材研究所， 貴陽 550006；3.安龍縣欣蔓生物科技有限責任公司， 貴州 安龍 552400；4.貴州惠稀生物科技有限公司， 貴州 三穗 556500)

白及[Bletillastriata(Thund.)Reichb.f.]為蘭科(Orchidaceae)白及屬多年生草本植物，又名良姜、紫蘭、甘根等。在我國主要分布于陜西、甘肅、廣西、福建、四川、浙江、廣東、云南及貴州等省，在朝鮮半島和日本也有分布[1]，最適宜區(qū)為貴州省安龍縣、興義市[2]。白及以干燥塊莖入藥，具收斂止血、消腫生肌之功效，治療咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等癥[3]。近年來，白及遭到掠奪式采挖，生境和賴以生存的氣候環(huán)境日益惡化，野生資源瀕臨滅絕[4]。貴州自古就是白及道地產(chǎn)區(qū)，品質、療效優(yōu)良，白及種子細小如塵，發(fā)育不完全，僅具尚未分化的原胚，在自然條件下很難萌發(fā)。貴州喀斯特山區(qū)土層淺薄、生態(tài)環(huán)境脆弱，碳酸鹽巖溶蝕是喀斯特山區(qū)主要成土方式[5]。碳酸鹽土壤中富含豐富的鈣(Ca2+)。土壤的鈣含量可達1%～3%，是同緯度硅酸鹽地區(qū)土壤的2～3倍[6]。Ca2+是植物體生長發(fā)育必需的礦質營養(yǎng)元素，參與組成細胞壁及細胞膜的結構等[7]。盡管在喀斯特地區(qū)土壤中Ca2+含量很高，但可利用性很低，而Ca2+在植物體內較難移動，導致植物各個器官缺鈣成為一個普遍性問題[8]。

因此，以植物組織培養(yǎng)為基礎，對Ca2+脅迫下白及種子萌發(fā)及原球莖發(fā)育過程的微形態(tài)學進行觀察，探討Ca2+脅迫下白及種子無菌萌發(fā)特性與適宜的培養(yǎng)條件，以期為白及種子萌發(fā)與幼苗建成提供形態(tài)學資料，以獲得白及快速繁殖機制。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1材 料

試驗材料選用成熟的白及蒴果，采自貴州省農(nóng)業(yè)科學院中藥材資源圃。

1.1.2儀 器

MLS-3750日本三洋(SANYO)全自動高壓蒸汽滅菌器(上海道薩生物科技發(fā)展有限公司)；SW-CJ-1G單人凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；BX 43生物顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1果實預處理

將未開裂的白及蒴果用流動的無菌水洗凈，在超凈工作臺上分別用0.1% HgCl2溶液表面消毒1 min，75%乙醇溶液消毒3 min。然后用已滅菌的剪刀縱向剪開蒴果，用鑷子夾取粉末狀種子，均勻地抖落在培養(yǎng)基表面。

1.2.2培養(yǎng)基制備

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加3%蔗糖、7%瓊脂、0.2 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-16-BA，對大量元素中Ca2+進行梯度處理，分別為0倍Ca2+(0 g·L-1)、1倍Ca2+(1.65 g·L-1)、1.5倍Ca2+(2.47 g·L-1)、2倍Ca2+(3.3 g·L-1)、2.5倍Ca2+(4.12 g·L-1)、3倍Ca2+(4.95 g·L-1)。培養(yǎng)基配置后于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min備用。

1.2.3培養(yǎng)條件

溫度為(24±1)℃，光照時間12 h·d-1，光照強度2 000 lx左右。

1.2.4結果觀察統(tǒng)計

對接種的種子每隔10 d取樣一次，觀察種子萌發(fā)及原球莖發(fā)育過程特征。體式顯微鏡(OLYMPUS BX 43)和數(shù)碼相機(OLYMPUS DP 22)拍照記錄實驗結果。統(tǒng)計種子的有效萌發(fā)數(shù)及原球莖直徑，結果采用 Microsoft Excel 2010、GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)整理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 Ca2+脅迫下白及種子萌發(fā)

白及蒴果成熟后，兩端呈稍尖的類圓柱體形，蒴果內部包含數(shù)萬粒細如塵埃的種子(圖1 A)。成熟種子呈橄欖型、粉末狀，由種皮和胚組成，不含胚乳[9](圖1 B)。將白及種子均勻散播于不同Ca2+濃度脅迫的培養(yǎng)基中，5 d后種子均吸水膨脹，顏色變淺，無明顯差別(圖2 A～F)；接種10 d后種子絕大部分變?yōu)榫G色，頂端和中心位細胞突起，分化出葉原基(圖3 A～F)，其中2.47 g·L-1Ca2+脅迫處理下，白及種子率先撐破種皮(圖3 C)；20 d后種子均突破種皮，除0 g·L-1Ca2+脅迫處理下的種子未分化出幼葉外，其他種子均由葉原基分化出第一片幼葉(圖4 A～F)，其中3.3 g·L-1Ca2+脅迫處理下的種子葉片長勢最優(yōu)(圖4 D)；30 d后0 g·L-1Ca2+脅迫處理的種子分化出一片幼葉，其他種子均分化出兩片幼葉(圖5 A～F)，2.47 g·L-1Ca2+脅迫和3.3 g·L-1Ca2+脅迫處理下的種子幼葉長勢較好。

注：A為白及蒴果與種子；B為白及種子的形態(tài)結構(4×10)。圖1 白及蒴果與種子Fig.1 Capsule and seed of B. striata

注：A為0 g·L-1 Ca2+脅迫;B為1.65 g·L-1 Ca2+脅迫；C為2.47 g·L-1 Ca2+脅迫；D為3.3 g·L-1 Ca2+脅迫；E為4.12 g·L-1 Ca2+脅迫；F為4.95 g·L-1 Ca2+脅迫。下同。圖2 5 d時白及種子萌發(fā)的形態(tài)結構(4×10)Fig.2 Morphological structure of seed germination of B. striata at 5 d (4×10)

圖3 10 d時白及種子萌發(fā)的形態(tài)結構(4×10)Fig.3 Morphological structure of seed germination of B. striata at 10 d (4×10)

圖4 20 d時白及種子萌發(fā)的形態(tài)結構(4×10)Fig.4 Morphological structure of seed germination of B. striata at 20 d (4×10)

圖5 30 d時白及種子萌發(fā)的形態(tài)結構(4×10)Fig.5 Morphological structure of seed germination of B. striata at 30 d (4×10)

2.2 Ca2+脅迫下原球莖形態(tài)學觀察

白及種子10 d后開始萌發(fā)，形成淡綠色近棒狀體和近球體的原球莖，各培養(yǎng)基無明顯差異；在20 d后，基部逐漸膨大，顏色逐漸加深，脫落種皮，原球莖分化明顯，原球莖呈近棒狀體和近球體；30 d后原球莖直徑達到1 mm左右，基部長出大量毛狀根，根部大量吸收養(yǎng)分以滿足植株迅速發(fā)育(圖6)。不同Ca2+脅迫下的培養(yǎng)基在30 d內原球莖都能分化，形成毛狀根，但生長速度不同。

2.3 不同Ca2+脅迫對白及種子萌發(fā)率的影響

在培養(yǎng)15 d后，采用蘇瑩等[10]的觀察統(tǒng)計法，統(tǒng)計不同Ca2+脅迫對白及種子萌發(fā)率的影響。由圖7可知，Ca2+濃度為2.47 g·L-1時萌發(fā)率最高，其次是1.65 g·L-1和0 g·L-1，當Ca2+濃度超過2.47 g·L-1時，則會抑制白及種子的萌發(fā)。

注：A為原球莖基部長出毛狀根(→)；B為近棒狀體的原球莖(→)。圖6 白及原球莖的形態(tài)結構(4×10)Fig.6 Morphological structure of B. striata procorm (4×10)

圖7 不同濃度Ca2+脅迫對白及種子萌發(fā)率的影響Fig.7 Effects of different concentrations of Ca2+ stress on the germination rate of B. striata seeds

2.4 不同Ca2+脅迫對原球莖直徑的影響

白及種子吸水膨大，30 d后形成綠色近棒狀體和近球體的原球莖。從圖8可知，在30 d后，有Ca2+和無Ca2+參與下，差異較明顯，0 g·L-1對原球莖直徑影響不大，而4.95 g·L-1則能明顯的促進白及原球莖直徑。

圖8 不同濃度Ca2+脅迫對原球莖直徑的影響Fig.8 Effects of different concentrations of Ca2+ stress on the diameter of procorm

3 結論與討論

在白及種子的萌發(fā)過程中，添加不同濃度的外源Ca2+，當Ca2+達到2.47 g·L-1時，對白及種子的萌發(fā)與生長有一定的促進作用，而高濃度的Ca2+則對其有一定的阻礙和抑制作用；然而在白及種子原球莖的生長發(fā)育過程中，在有Ca2+和無Ca2+參與下，差異較明顯，0 g·L-1Ca2+對原球莖直徑影響不大，而4.95 g·L-1Ca2+則能明顯的促進白及原球莖直徑。

Ca2+是植物生長發(fā)育的必須元素之一，Ca2+在細胞分裂、極性形成、生長、分化、凋亡等過程中均有重要的調節(jié)功能。Ca2+還是植物細胞壁的重要組成成分，是液泡內重要的滲透保護物質，具有維持細胞內離子平衡并保持細胞膜穩(wěn)定等功能[11]。植物細胞體內存在一套完整嚴密的調節(jié)體系，當外源Ca2+過高會引起細胞的反饋調節(jié)，過低則不能滿足正常生理需要[12]。適當加入一定濃度的外源Ca2+，能夠降低細胞膜滲透率，增加可溶性糖的積累及減緩葉綠素降解等，是細胞內多種酶的活化劑[13]。作為第二信使，Ca2+與受體蛋白如鈣調蛋白(CaM)、類鈣調磷酸酶B亞基蛋白(CBL)、鈣離子結合蛋白激酶(CDPK)等結合，參與了植物對內環(huán)境(發(fā)育)和外環(huán)境的感知和傳導[14]。而且還能穩(wěn)定的直接參與植物抵抗低溫、高溫、干旱和鹽脅迫等逆境[15]。有研究表明，在植物細胞的液泡中存在著大量的Ca2+庫，除了植物自身釋放Ca2+外，適當?shù)募尤胍欢舛鹊腃a2+，能夠調高亞麻種子的發(fā)芽率和幼苗抗旱性[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，加入適當?shù)耐庠碈a2+能有效調節(jié)白及種子的萌發(fā)率，因濃度不同，則表現(xiàn)不同，當濃度達到2.47 g·L-1時，能夠促進白及種子的萌發(fā)，當大于2.47 g·L-1時，則會抑制其萌發(fā)，而Ca2+是如何促進白及種子萌發(fā)的，這個機制還需要進一步研究和探討；然而，在原球莖的生長過程中，當Ca2+濃度達到4.95 g·L-1時，對白及的原球莖直徑有明顯的促進作用。