朱祎婧，艾智華，鐘大鵬

糖尿病的主要特征是體內(nèi)的糖脂代謝發(fā)生紊亂，伴隨著血葡萄糖的升高[1]。作為分泌胰島素的重要來(lái)源，胰島β 細(xì)胞在能量代謝平衡及糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演了重要角色[2]。近年來(lái)，針對(duì)糖尿病患者以及糖尿病動(dòng)物模型的研究提示：胰島β細(xì)胞損害及功能障礙，可能與體內(nèi)過(guò)多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝產(chǎn)物所引發(fā)的慢性非特異炎癥的持續(xù)有關(guān)[3-5]。Toll 樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）可誘導(dǎo)多種炎癥因子的釋放，進(jìn)而發(fā)揮免疫作用[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)高糖高脂可抑制胰島β 細(xì)胞的增殖,同時(shí)上調(diào)了TLR3、TNF-α、IL-1β 等炎癥因子的表達(dá)，這表明TLR3 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與了高脂、高糖誘導(dǎo)的胰島β 細(xì)胞的損傷[7]。予以TLR3 特異性激動(dòng)劑聚肌胞（PIC）刺激可明顯抑制胰島β 細(xì)胞分泌胰島素的功能，且炎性因子表達(dá)明顯升高[8]。上述研究結(jié)果表明，激活胰島β 細(xì)胞TLR3 會(huì)抑制其增殖和功能，潛在的機(jī)制可能與TLR3 激活誘導(dǎo)TNF-α，促進(jìn)炎癥因子的合成與釋放有關(guān)[8]。但TLR3 受體激活誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具體是如何影響胰島β 細(xì)胞尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 選用含雙抗（100 U/ml青霉素和100 mg/ml 鏈霉素）的DMEM 培養(yǎng)基（SH30243.01B，Hyclone 公司）培養(yǎng)小鼠胰島β 細(xì)胞株（NIT-1，武漢普賽諾生命科技有限公司），觀察細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行細(xì)胞傳代。將細(xì)胞接種于96 孔板(每孔約7×103個(gè)的細(xì)胞)后改用含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，換用含0.1% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基予細(xì)胞同步化處理。所有細(xì)胞經(jīng)同步化處理24 h 后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞貼壁后予以PIC（10108812001，Sigma）刺激48 h。實(shí)驗(yàn)分4 組：Blank 組、30 μg/ml PIC 組、60 μg/ml PIC 組、90 μg/ml PIC 組。

1.2 流式檢測(cè)細(xì)胞周期 用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰蛋白酶消化細(xì)胞后用PBS 洗滌。將細(xì)胞懸液離心（1000 r/min，5 min）處理（重復(fù)兩次），棄上清留取細(xì)胞沉淀。將70%乙醇預(yù)冷處理，然后緩慢加入用PBS 重懸的細(xì)胞沉淀（約5×105～106個(gè)細(xì)胞），混勻后在4 ℃條件下固定過(guò)夜。次日細(xì)胞沉淀離心后加入PBS 后再次離心（1500 rr/min，10 min），重復(fù)兩次取細(xì)胞沉淀，避光環(huán)境下向細(xì)胞沉淀中加入200 μl 預(yù)先配好的DNA 染液（PI solution 20 μg+Triton x-100 1 μl+Rnase A solution 0.2 mg+PBS 定容到1 ml），在室溫下孵育15 min 后流式細(xì)胞儀檢測(cè)（Cyt-Expert，Beckman 公司）。

1.3 PCR 檢測(cè)NF-κB 及TRIF 的mRNA 表達(dá) 采用RNA 提取試劑盒（TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit，Cat.# 9767)進(jìn)行RNA 提取。于冰上配制反應(yīng)混合液（gDNA Eraser 1 μl,5X gDNA Eraser buffer 2 μl,Total RNA 7 μl），加入RNA 樣品后立即在42 ℃反應(yīng)2 min，然后置于4 ℃保持。2%瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)樣品RNA 完整性進(jìn)行檢測(cè)并用DNA/RNA 測(cè)定儀測(cè)定混合物濃度和純度。根據(jù)合成的引物檢測(cè)TRIF 及NF-κB 的mRNA 表達(dá)量，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照RT-PCR 試劑盒（iQTMSYBRRGreen Supermix kit，Bio-Rad）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。根據(jù)Gene-bank 提供的基因序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物序列(表1)。

表1 引物序列

1.4 檢 測(cè)TRIF、NF-κB、CyclinD1 及Caspase-3 蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞樣本經(jīng)RIPA 裂解后離心（12000 r/min，10 min）取上清,采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。制備分離膠和濃縮膠，待濃縮膠聚合后將待測(cè)樣品與等體積蛋白loading 添加至加樣孔，電泳后依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、洗滌、發(fā)光。一抗抗體稀釋比例信息見(jiàn)表2。

表2 一抗抗體稀釋比例信息

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較采用方差分析（one-way ANOVA），P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞周期檢測(cè) 通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞增殖的情況（圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，隨著PIC 刺激濃度的增加，NIT-1 細(xì)胞停留在G0/G1 期細(xì)胞的比例明顯上調(diào)（P<0.01），而在S 期和G2/M 期的細(xì)胞比例出現(xiàn)明顯下調(diào)（P<0.01）。

圖1 流式細(xì)胞周期統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 TRIF、NF-κB mRNA 表達(dá) 與Blank 組比較，胰島β 細(xì)胞TRIF 和NF-κB 的mRNA 表達(dá)量隨著PIC 刺激濃度的升高而增高（圖2）。在低濃度PIC（30 μg/ml）刺激時(shí)，mRNA 表達(dá)出現(xiàn)了上調(diào)趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而在中等濃度和高濃度時(shí)mRNA 表達(dá)量明顯上調(diào)（P<0.01）。

圖2 TRIF 與NF-κB mRNA 表達(dá)情況

2.3 蛋白表達(dá) 細(xì)胞周期蛋白CCND1 表達(dá)量（圖3）在不同濃度PIC 刺激下均明顯下調(diào)（P<0.01），且與PIC 刺激濃度的升高呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；pro-CASP3在低濃度和中濃度PIC 刺激時(shí)表達(dá)量上調(diào)程度明顯低于高濃度刺激（P<0.01），而cleaved-CASP3蛋白表達(dá)量的升高幅度呈濃度依賴性（P<0.01）；TRIF 蛋白表達(dá)在經(jīng)不同濃度PIC 干預(yù)后呈現(xiàn)明顯上調(diào)（P<0.01）；NF-κB 蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)濃度依賴性上升（P<0.01）。

3 討論

盡管引起糖尿病的原因眾多，但似乎都與誘發(fā)組織細(xì)胞氧化應(yīng)激的增加，進(jìn)而引起一系列炎癥因子的激活有關(guān)[9]。炎癥因子的激活將導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能受到損傷、外周組織對(duì)胰島素的敏感性降低即胰島素抵抗的形成[10]。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)予以高脂高糖刺激會(huì)明顯抑制NIT1 細(xì)胞細(xì)胞增殖，同時(shí)其分泌胰島素的功能也受到了極大的抑制[7]。本研究證實(shí)了PIC 刺激NIT1 細(xì)胞株可使大量增殖細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G0/G1 期，而未能繼續(xù)分裂成熟到S/G2 期，且對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。有研究表明，CCND1 的表達(dá)對(duì)維持胰島β 細(xì)胞的數(shù)量上發(fā)揮了重要作用，過(guò)表達(dá)CCND1 明顯上調(diào)了人胰島β 細(xì)胞的增殖[11]。而在此實(shí)驗(yàn)中，NIT1 細(xì)胞經(jīng)PIC 刺激后，CCND1 的表達(dá)受到了明顯抑制，且呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢(shì)，提示PIC 刺激在阻斷胰島β 細(xì)胞從G1 期進(jìn)入S 期的過(guò)程中，CCND1 可能是TLR3 信號(hào)通路的作用靶點(diǎn)。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡的過(guò)程。目前的研究認(rèn)為Caspase 家族是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要分子[12]，其中Caspase 3 被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最重要的效應(yīng)型Caspase[13]。本研究予以不同濃度PIC 處理后，凋亡相關(guān)蛋白分子Caspase3 的表達(dá)出現(xiàn)了明顯改變，提示予以PIC刺激后激活了細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞增殖受抑制以及凋亡增加，這可能是導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞數(shù)量的減少和（或）胰島素分泌不足的原因。

TLR3 參與了機(jī)體重要免疫作用，它可識(shí)別病毒來(lái)源的dsRNA 及其類似物PIC 觸發(fā)促炎細(xì)胞因子的釋放[14]。對(duì)比TLR3 敲除小鼠與野生型小鼠發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)下，TLR3 敲除小鼠的糖耐量和脂質(zhì)狀況有所改善，還有促炎細(xì)胞因子和炎癥趨化因子基因表達(dá)的下調(diào)，這表明TLR3 可能是糖脂代謝中的重要調(diào)節(jié)分子[15]。本課題前期研究結(jié)果證實(shí)，高脂高糖刺激會(huì)上調(diào)TLR3 的表達(dá)，而艾塞那肽可改善糖脂毒性對(duì)胰島β 細(xì)胞的增殖抑制,下調(diào)糖脂毒性誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)，可能與TLR3 信號(hào)通路被抑制有關(guān)[16]。在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中，TLRS（除TLR3）都可通過(guò)髓樣分化反應(yīng)蛋白88（MyD88）依賴途徑誘導(dǎo)相關(guān)炎癥因子的釋放[17]。除了MyD88 依賴信號(hào)通路，TLR 還可以與TRIF 相關(guān)接頭分子結(jié)合以招募TRIF 結(jié)合蛋白，TRIF 活化后可激活TANK 結(jié)合激酶1，進(jìn)而再激活干擾素調(diào)節(jié)因子3，誘導(dǎo)分泌炎性因子IFN-β。與其他TLR 不同的是，TLR3 不依賴MyD88 信號(hào)通路，可直接激活TRIF 相關(guān)信號(hào)通路，介導(dǎo)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。本次實(shí)驗(yàn)予以TLR3 特異性激動(dòng)劑PIC 刺激NIT1 細(xì)胞后，TLR3 與其下游TRIF 的mRNA 表達(dá)逐漸上調(diào)，且與刺激的PIC 濃度呈正相關(guān)，這表明TLR3-TRIF 信號(hào)通路的激活在胰島β 細(xì)胞損傷中可能發(fā)揮了重要作用。同時(shí)，TLR3-TRIF 下游信號(hào)通路中NF-κB 也被PIC 活化，且隨PIC 刺激濃度的增加而增加。提示NIT1 細(xì)胞增殖受抑制以及凋亡的增加可能與TLR3-TRIFNF-κB 炎癥信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制胰島β 細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，誘導(dǎo)β 細(xì)胞凋亡和功能障礙有關(guān)。