李東紅，胥芷靈，徐翠珊，賈永艷，3，張運克，2

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；3.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州450046

中風(fēng)，又稱卒中，始見于張仲景《金匱要略》，是以半身不遂、肌膚不仁、口舌歪斜、言語不利，甚則突然昏仆、不省人事為主要表現(xiàn)的病癥，屬中醫(yī)四大疑難病癥之首［1］，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的急性腦血管疾病，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的特點，嚴(yán)重威脅人類健康［2］。歷代醫(yī)家對于中風(fēng)有不同見解。明清時期，王清任認(rèn)為，其發(fā)病機(jī)制在于氣虛血瘀，治療需遵循養(yǎng)陰益氣，活血化瘀和疏通經(jīng)絡(luò)?！夺t(yī)林改錯·論抽風(fēng)不是風(fēng)》言：“元氣既虛，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀。以一氣虛血瘀之癥?！辈⑹状问蛰d了補(bǔ)陽還五湯一方［3-6］。補(bǔ)陽還五湯由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁和紅花7味中藥組成，具有補(bǔ)氣通絡(luò)的功效，是中藥方劑中益氣活血的經(jīng)典方劑，在中風(fēng)的臨床治療中發(fā)揮了極大的作用［7-12］。但是對于補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)的有效成分及作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從補(bǔ)陽還五湯所含成分入手，通過TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺預(yù)測其靶點，并與中風(fēng)疾病相關(guān)靶點進(jìn)行對比篩選，使用Cytoscape3.6.0數(shù)據(jù)可視化軟件制作中藥復(fù)方成分-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。通過STRING在線軟件，得到中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)蛋白作用網(wǎng)絡(luò)及中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)核心蛋白作用網(wǎng)絡(luò)。最后使用Metascape數(shù)據(jù)庫與微生信在線作圖工具，制作GO富集分析與KEGG通路富集分析氣泡圖，以預(yù)測該方劑治療中風(fēng)的有效成分及作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 補(bǔ)陽還五湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的構(gòu)建通過TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索補(bǔ)陽還五湯中7味中藥所含化學(xué)成分，以O(shè)B（口服生物利用度）值≥30%、DL（類藥性）值≥0.18為篩選條件獲得各個中藥所含化學(xué)成分，構(gòu)建補(bǔ)陽還五湯所含化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2 靶點預(yù)測基于補(bǔ)陽還五湯所含化學(xué)成分，通過TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺對該方劑所含化學(xué)成分進(jìn)行化合物-蛋白質(zhì)作用靶點預(yù)測，利用Uniprot蛋白質(zhì)生物功能數(shù)據(jù)庫（http：//www.Uniprot.org/），獲得相關(guān)基因靶點，矯正蛋白質(zhì)名稱。

1.3 中風(fēng)疾病靶點篩選以“Acute cerebrovascular disease”為關(guān)鍵詞在GeneCards人類基因數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）及OMIM在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）中檢索，得到中風(fēng)疾病靶點。

1.4 中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)的獲取通過1.2項及1.3項獲得補(bǔ)陽還五湯相關(guān)作用靶點及中風(fēng)疾病靶標(biāo)后，取兩者的靶點基因交集。

1.5 中藥復(fù)方成分-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將1.4項所得中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)與補(bǔ)陽還五湯所含活性成分對應(yīng)，通過Cytoscape3.6.0數(shù)據(jù)可視化軟件（http：//cytoscape.org/）處理，得到中藥復(fù)方成分-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶標(biāo)的篩選將1.4項中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)導(dǎo)入STRING在線軟件（https：//string-db.org/），選擇人類基因庫，得到補(bǔ)陽還五湯作用于中風(fēng)的PPI蛋白作用網(wǎng)絡(luò)。

1.7 GO富集分析與KEGG通路富集分析將中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/gp/index.html），選擇物種為人類，得到基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of gene and genome，KEGG）通路富集分析信息。

2 結(jié)果

2.1 中藥復(fù)方成分-疾病靶標(biāo)的獲取與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺分別尋找補(bǔ)陽還五湯全部活性成分（地龍未收錄，通過查閱文獻(xiàn)［13］，得到其活性成分名稱、結(jié)構(gòu)式、CAS號，通過CAS號在TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢），設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18，進(jìn)行初步篩選。并在該數(shù)據(jù)庫內(nèi)進(jìn)行活性成分-蛋白靶點的預(yù)測，保留具有蛋白靶點的活性成分。利用Uniprot蛋白質(zhì)生物功能數(shù)據(jù)庫（http：//www.Uniprot.org/），獲得相關(guān)基因靶點，除去找不到基因靶點的成分，共得到補(bǔ)陽還五湯活性成分63個，相關(guān)靶點242個。以“Acute cerebrovascular disease”為關(guān)鍵詞在GeneCards人類基因數(shù)據(jù)庫及OMIM在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫中搜索疾病相關(guān)靶點信息，整合二者所得數(shù)據(jù)，得到中風(fēng)相關(guān)疾病靶點1 732個。利用韋恩圖進(jìn)行分析，取補(bǔ)陽還五湯中所含成分靶點及中風(fēng)疾病靶點交集，獲得中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)136個，藥物-疾病基因映射率為56.2%，見圖1。將中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)與補(bǔ)陽還五湯所含活性成分對應(yīng)，得到補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)的活性成分20個，見表1。通過Cytoscape3.6.0數(shù)據(jù)可視化軟件（http：//cytoscape.org/）處理，得到中藥復(fù)方成分-靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，見圖2，其中來自黃芪與紅花的共有成分槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol），黃芪與桃仁共有成分常春藤皂苷元（hederagenin），當(dāng)歸、赤芍、桃仁與紅花共有成分β-谷甾醇（beta-sitosterol）作用尤為明顯。

圖1 補(bǔ)陽還五湯成分靶點-中風(fēng)疾病靶點韋恩圖

圖2 中藥復(fù)方活性成分-疾病靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

表1 補(bǔ)陽還五湯作用于中風(fēng)疾病靶點及對應(yīng)活性成分

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶標(biāo)的篩選將中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)導(dǎo)入STRING在線軟件，選擇人類基因庫，得到中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，并下載結(jié)果文件。將結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.0數(shù)據(jù)可視化軟件，進(jìn)行權(quán)重分析，計算degree值，將degree值＞59（二倍中位數(shù)）作為篩選依據(jù)，得到中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)核心蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，見圖3。其中核心靶標(biāo)按照degree值從大到小依次為AKT1、IL-6、ALB、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8、PTGS2、CASP3、MAPK8、JUN、EGF、IL-1B、MAPK1、NOS3、MMP9、EGFR、CAT、CCL2、FOS、IL-10、ESR1、MMP2、IL-4。

圖3 中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)蛋白作用網(wǎng)絡(luò)及核心蛋白作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO富集分析將中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，選擇物種為人類，得到基因本體論（GO）富集分析信息，保存文件。以基因數(shù)作為篩選依據(jù)，GO富集分析選擇前10項，作GO Biological process（BP）、GO Cellular component（CC），GO Molecular function（MF）三合一柱形圖，見圖4。GO富集分析提示，補(bǔ)陽還五湯活性成分主要富集在無機(jī)物應(yīng)答、毒性物質(zhì)應(yīng)答、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、含氮化合物的纖維素反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、纖維素酯、細(xì)菌應(yīng)答、有機(jī)環(huán)化合物的細(xì)胞反應(yīng)、激素刺激的細(xì)胞反應(yīng)、凋亡信號通路等；在分子組成方面，主要與膜筏、膜微域、膜區(qū)、突觸后、突觸膜、軸突、受體復(fù)合體、液泡、突觸后膜、突觸前等相關(guān)；在分子功能方面，主要涉及蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、氧化還原酶活性、蛋白質(zhì)均二聚體活性、蛋白激酶結(jié)合、激酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、協(xié)因子綁定、受體調(diào)節(jié)活性、近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合RNA聚合酶Ⅱ等。

圖4 BP、CC、MF三合一柱形圖

2.4 KEGG通路富集分析將中藥復(fù)方-疾病靶標(biāo)導(dǎo)入Metascape，選擇物種為人類，得到京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析信息，保存文件。以基因數(shù)作為篩選依據(jù)，選擇富集分析信息前20項，見表2。最后用微生信在線作圖工具作KEGG通路富集分析氣泡圖，見圖5。由KEGG通路富集分析信息可知，補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)疾病的KEGG通路主要有癌癥通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎病毒、IL-17信號通路、結(jié)核病、TNF信號通路、弓形體病、蛋白聚糖在癌癥的作用、恰加斯?。乐掊F蟲?。?、MAPK信號通路、細(xì)胞凋亡、非酒精性脂肪肝、甲型流感、細(xì)胞因子-受體相互作用、百日咳、HTLV-I感染、HIF-1信號通路及直腸癌等。

表2 KEGG通路富集分析信息表

圖5 KEGG通路富集信息氣泡圖

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論和方法，使用數(shù)據(jù)庫及相關(guān)工具尋找補(bǔ)陽還五湯活性成分及靶點，篩選補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)的活性成分、靶標(biāo)及核心靶標(biāo)，構(gòu)建中藥復(fù)方活性成分-疾病靶標(biāo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、中藥復(fù)方疾病靶標(biāo)蛋白作用網(wǎng)絡(luò)、中藥復(fù)方疾病靶標(biāo)核心蛋白作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）及GO、KEGG通路富集分析研究補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)的有效成分及作用機(jī)制。結(jié)果表明補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)有效成分20個，其中君藥黃芪與紅花共有成分槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol），黃芪與桃仁共有成分常春藤皂苷元（hederagenin），當(dāng)歸、赤芍、桃仁與紅花共有成分β-谷甾醇（beta-sitosterol）作用最明顯。其中槲皮素（quercetin）具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗炎、抗菌等生理活性［14-15］，并且具有降血糖、降血壓、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗血栓和防止冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等多種心血管保護(hù)作用［16］；山奈酚（kaempferol）具有抗癌、抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、疾病預(yù)防、心肌保護(hù)、抗慢性腦缺血等藥理作用［17-18］；常春藤皂苷元（hederagenin）具有抗腫瘤、抗抑郁、抗菌抗炎、抗糖尿病、神經(jīng)保護(hù)以及改善高脂血癥血液流變學(xué)等藥理作用［19］；β-谷甾醇（beta-sitosterol）具有抗氧化、降低膽固醇、抗炎、抗焦慮及抗驚厥等藥理作用［20］。但是，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫以O(shè)B≥30%，DL≥0.18篩選補(bǔ)陽還五湯中活性成分時，君藥黃芪的主要成分黃芪皂苷中大多化合物未通過篩選，所以通過TCMSP數(shù)據(jù)庫以O(shè)B≥30%，DL≥0.18篩選補(bǔ)陽還五湯中活性成分可能會存在某些主要成分的丟失。

中藥復(fù)方補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)的核心靶點主要有：AKT1、IL-6、ALB、TNF、VEGFA、TP53、CXCL8、PTGS2、CASP3、MAPK8、JUN、EGF、IL-1B、MAPK1、NOS3、MMP9、EGFR、CAT、CCL2、FOS、IL-10、ESR1、MMP2、IL-4。其中AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究表明AKT1在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)時，在動脈粥樣硬化形成過程中起著關(guān)鍵作用，并且可以調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化進(jìn)展過程中的血管重塑［21］，與腫瘤、心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病發(fā)生相關(guān)［22-23］；IL-6、TNF、IL-1B、IL-10、IL-4均為重要的炎癥因子，參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種炎癥反應(yīng)［24］，其中IL-6是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的主要炎癥標(biāo)志物，TNF的亞型TNF-α能夠增加損傷血管中炎性細(xì)胞數(shù)量，并通過協(xié)助血管平滑肌重塑參與動脈粥樣硬化的病理過程；ALB、VEGFA、CXCL8會影響人體血液流變學(xué)［25-28］，血清中ALB水平的異常變化可能會引起腦梗死的復(fù)發(fā)［29］，VEGFA通過與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，可以調(diào)節(jié)血管和淋巴管的生成；TP53可以調(diào)控細(xì)胞分裂與增殖；PTGS2基因的表達(dá)產(chǎn)生環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2），環(huán)氧合酶（cyclooxygenase，COX）參與花生四烯酸合成血栓素A2的過程，促進(jìn)血小板聚集；MMP9和MMP2是細(xì)胞外基質(zhì)重塑的關(guān)鍵效應(yīng)物，MMP2參與神經(jīng)纖維間質(zhì)的浸潤和分解過程，與腦組織損傷狀況關(guān)系密切［30］。

中藥復(fù)方補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)的主要通路有癌癥的途徑、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎病毒、IL-17信號通路、結(jié)核病、TNF信號通路、弓形體病、蛋白聚糖在癌癥的作用、恰加斯?。乐掊F蟲病）、MAPK信號通路、細(xì)胞凋亡、非酒精性脂肪肝、甲型流感、細(xì)胞因子-受體相互作用、百日咳、HTLV-I感染、HIF-1信號通路、直腸癌等。研究表明高膽固醇血癥誘發(fā)的動脈粥樣硬化可能是通過AGE-RAGE介導(dǎo)的，可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體通過與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體競爭能抑制動脈粥樣硬化［31］；流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路在血脂異常向動脈粥樣硬化發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要作用；流體剪切應(yīng)力是血液與內(nèi)皮之間的摩擦力，是決定內(nèi)皮功能和基因表達(dá)的主要因素，可以調(diào)整血管通透性［32］；激活PI3K-AktmTOR通路能保護(hù)大腦缺血再灌注損傷，具有神經(jīng)保護(hù)功能，可抑制氧化應(yīng)激相關(guān)的神經(jīng)元自噬［33］；IL-17通路被激活后可以加速血管的動脈粥樣硬化過程［34］；HIF-1信號通路可以調(diào)節(jié)血脂的代謝。由此可以看出，補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)主要通過影響細(xì)胞凋亡與再生、改善血液流變學(xué)、影響人體代謝水平等方面多通路達(dá)到治療效果。

綜上所述，該研究通過對補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究進(jìn)一步明確了補(bǔ)陽還五湯治療中風(fēng)的有效成分、靶點及作用機(jī)制，這也進(jìn)一步證明了中藥治療疾病的整體性原則，在發(fā)揮治療疾病作用時，將人體作為一個整體，通過多成分-多靶點-多通路達(dá)到治療疾病的目的。