楊鑫，徐晶，馬坤，王娜，楊廣德，南冠軍

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安 710004；2.陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068；3.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 710061)

柚皮苷(Naringin，NRG)是一種雙氫黃酮類(lèi)化合物，主要存在于蕓香科柚、葡萄柚和酸橙等植物中。柚皮苷具有多種生物學(xué)活性，如抗病毒、抗炎、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)痛等，還能通過(guò)調(diào)節(jié)血液中膽固醇水平，減少血栓從而改善局部微循環(huán)，達(dá)到防治血管性疾病的目的[1-2]。

胃蛋白酶(Pepsin，Pep)，又稱(chēng)胃液素，是人類(lèi)及多數(shù)哺乳動(dòng)物胃腸道內(nèi)的一種重要消化酶，對(duì)人類(lèi)而言，Pep分子量約為35 kDa， 在37～42 ℃的酸性環(huán)境中具有最強(qiáng)活性[3]，主要是通過(guò)水解聚氨基酸間的肽鍵鏈接使食物中的蛋白類(lèi)物質(zhì)被消化[4]。胃液中的前體物質(zhì)——胃蛋白酶原,在酸性條件下被激活后形成胃蛋白酶從而發(fā)揮作用[5]。胃蛋白酶目前被廣泛應(yīng)用于各類(lèi)工業(yè)和食品生產(chǎn)中，包括方便食品、奶制品、消化藥及口香糖加工制造，以及啤酒、果酒的澄清應(yīng)用方面[6]。

天然活性化合物和蛋白質(zhì)或酶等生物大分子的相互作用研究越來(lái)受到關(guān)注。小分子化合物與酶等生物大分子相互作用，一方面可能會(huì)引起酶的構(gòu)象改變，影響其活性；另一方面會(huì)影響小分子化合物的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)等[7]。鑒于NRG廣泛存在于一些水果中，Pep又是重要消化酶;因此有必要研究NRG和Pep的相互作用，從分子水平方面闡明NRG與Pep的作用特點(diǎn)[8-11]。因此本研究將通過(guò)研究NRG與Pep的熒光猝滅類(lèi)型、結(jié)合常數(shù)K、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n、作用力類(lèi)型、Pep構(gòu)象的變化，結(jié)合NRG與Pep的氨基酸殘基的距離r等關(guān)鍵參數(shù)的研究，并通過(guò)測(cè)定結(jié)合常數(shù)隨溫度的變化情況，進(jìn)一步確定NRG與Pep的作用機(jī)制及可能性，為分子水平上研究NRG與Pep的作用特點(diǎn)提供信息[12-15]。

1 儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)(RF-5310pc，日本島津公司)；紫外分光光度計(jì)(UV-2450，日本島津公司)；分析天平(AY120，日本島津公司)；循環(huán)恒溫水浴鍋(HWY-501, 上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司)；數(shù)顯pH計(jì)(PHS-29A，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；超純水機(jī)(1810B，上海摩勒生物科技有限公司)。

Pep(北京索萊寶科技有限公司，分析純)；NRG(西安冠宇生物技術(shù)公司，分析純)；檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙醇和氯化鈉(西安化學(xué)試劑廠，分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 儲(chǔ)備液的配制

2.1.1 檸檬酸-磷酸鹽緩沖液

先準(zhǔn)確稱(chēng)取檸檬酸21.01 g，然后用蒸餾水溶解并定容至1 000 mL；準(zhǔn)確稱(chēng)取十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)3.58 g，用蒸餾水溶解定容至50 mL。準(zhǔn)確稱(chēng)取5.85 g NaCl置1 000 mL容量瓶中，加入上述檸檬酸溶液530 mL和十二水合磷酸氫二鈉溶液20 mL，溶解完全后蒸餾水定容。

2.1.2 Pep標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取87.5 mg的Pep置100 mL容量瓶中，使用上述檸檬酸-磷酸鹽緩沖液溶解并定容，得到2.5×10-5mol/L的Pep標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 NRG儲(chǔ)備液的配制

精確稱(chēng)取10 mg NRG置10 mL容量瓶中，加入乙醇溶解定容，得到1.72×10-3mol/L 的NRG儲(chǔ)備液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 NRG與Pep相互作用的紫外吸收光譜

精密量取5 mL Pep標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用上述檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液稀釋至濃度為1.25×10-5mol/L，取與Pep相同摩爾濃度的NRG溶液，另取與相同濃度的Pep-NRG混合溶液于37 ℃反應(yīng)5min后，分別在200～400 nm范圍內(nèi)掃描紫外光譜。

2.2.2 NRG與Pep相互作用的熒光猝滅光譜

精密量取10 mL 1.25×10-5mol/L Pep稀釋液于比色管中，加入25 μL乙醇，恒溫水浴5 min，取2 mL于比色皿中，將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為280 nm,并將激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的狹縫寬度設(shè)為5 nm，獲得溶液在290 ～ 440 nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。逐次加入NRG儲(chǔ)備液置比色管中，每次2 μL，掃描后再將比色皿中的溶液倒回，搖勻，置于25 ℃恒溫水浴鍋中，恒溫5 min，重新取該溶液2 mL在原圖上掃描猝滅光譜，并記錄每次掃描的峰值的熒光強(qiáng)度。

將恒溫水浴溫度分別改為30 ℃和37 ℃，重復(fù)以上操作。

2.2.3 同步熒光光譜

室溫下，操作方法同“熒光猝滅光譜”。精密量取一定量濃度和體積的Pep稀釋液于比色管中，取2 mL于比色皿中，以Δλ = 15 nm和Δλ = 60 nm測(cè)定其同步熒光光譜(Δλ為發(fā)射波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)的差，即Δλ=λem- λex；激發(fā)光柵與發(fā)射光柵狹縫寬均為5 nm)，逐次加入NRG儲(chǔ)備液于比色管中，每次2 μL，掃描后再將比色皿中的溶液倒回，搖勻，靜置5 min，重復(fù)以上操作測(cè)定其同步熒光光譜。

2.2.4 三維熒光

室溫下，精密量取一定量濃度和體積的Pep稀釋液于比色管中，取2 mL于比色皿中，將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為從220 nm開(kāi)始，間隔為5 nm，直到400 nm為止，在220 ～ 500 nm范圍內(nèi)掃描熒光光譜，得出NRG-Pep的三維熒光光譜。

2.3 結(jié)果

2.3.1 NRG對(duì)Pep的猝滅作用

見(jiàn)圖1,圖1中a、b、c分別為在25、30、37 ℃下NRG對(duì)Pep的熒光猝滅光譜。NRG與Pep的相互作用機(jī)制可由熒光光譜的變化推斷得出。從圖中可以看出，隨著NRG濃度的增加，峰位和峰形基本不變，而Pep的熒光強(qiáng)度隨NRG濃度的增加而降低，由此可以推測(cè)NRG與Pep產(chǎn)生了相互作用。

注：圖中C (Pep) = 1.25×10-5 mol/L，圖中1～11熒光猝滅光譜對(duì)應(yīng)的的C (NRG) = 0、0.34、0.69、1.03、1.38、1.72、2.06、2.41、2.75、3.10、3.44×10-6 mol/L。圖1 在25 ℃ (a)，30 ℃ (b)，37 ℃ (c)不同溫度下NRG對(duì)Pep的熒光猝滅光譜

2.3.2 柚皮苷與胃蛋白相互作用的猝滅機(jī)理

根據(jù)Stern-Volmer方程[16]，即公式(1)，以F0/F為縱坐標(biāo)，Pep溶液中加入的NRG濃度[Q](×10-6mol/L)為橫坐標(biāo)作圖，可得到不同溫度情況下NRG對(duì)Pep的熒光猝滅曲線，并對(duì)曲線做線性回歸，見(jiàn)圖2。

(1)

其中，F(xiàn)0:熒光強(qiáng)度(不加猝滅劑)；F:熒光強(qiáng)度(加入猝滅劑)；Kq:雙分子表觀猝滅常數(shù);τ0:無(wú)猝滅劑條件下，熒光分子的平均壽命(約為10～8 s)；[Q]:猝滅劑濃度；Ksv:猝滅速率常數(shù)。

以F0/F為縱坐標(biāo)，猝滅劑濃度[Q]為橫坐標(biāo)，繪制Stern-Volmer曲線，回歸方程的斜率即為Ksv，同時(shí)求得Kq。

Ksv隨測(cè)試溫度升高而升高，見(jiàn)表1,初步推斷NRG對(duì)Pep的猝滅機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅。此外，由于雙分子表觀猝滅常數(shù)Kq值均遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)，說(shuō)明引起熒光體熒光猝滅的主要原因可能是形成了新的配合物，猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅，所以可以推出Pep的熒光猝滅可能不是分子擴(kuò)散和碰撞引起的動(dòng)態(tài)猝滅，而是形成新的復(fù)合物引起的復(fù)合式靜態(tài)猝滅。

注：●表示25 ℃;█表示30 ℃;▲表示37 ℃。圖2 在不同溫度下NRG對(duì)Pep的熒光猝滅曲線

表1 NRG對(duì)Pep的Stern-Volmer回歸方程及猝滅常數(shù)

2.3.3 柚皮苷與胃蛋白酶的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

根據(jù)公式(2)計(jì)算NRG與Pep的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。用lg[(F0-F)/F] 對(duì)lg[Q] 作雙對(duì)數(shù)圖，對(duì)數(shù)據(jù)作線性擬合，直線斜率即為不同溫度下NRG與Pep的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。結(jié)果如圖3所示，并將其相關(guān)系數(shù)列于表2中。

(2)

注：●表示25 ℃；█表示30 ℃；▲表示37 ℃。圖3 不同溫度下NRG對(duì)Pep熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)曲線

表2 NRG與Pep的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

由斜率知，NRG與Pep的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n≈1下，二者結(jié)合時(shí)，存在約1個(gè)單獨(dú)的結(jié)合位點(diǎn)，即大約1個(gè)NRG分子與1個(gè)Pep分子結(jié)合形成配合物。

2.3.4 柚皮苷與胃蛋白酶相互作用的作用力類(lèi)型

用對(duì)應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)的自然對(duì)數(shù)lnK對(duì)1/T作圖，線性擬合得到圖4，再根據(jù)公式(3)和(4)，可計(jì)算得到結(jié)合反應(yīng)的ΔG，ΔH，ΔS等熱力學(xué)函數(shù)的變化值，所得結(jié)果見(jiàn)表3。

(3)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK

(4)

式中K表示溫度為T(mén)時(shí)的結(jié)合常數(shù)；T表示絕對(duì)溫度；R表示普適氣體常量；ΔG表示反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)摩爾吉布斯自由能變；ΔH表示反應(yīng)焓變；ΔS表示反應(yīng)熵變。

藥物分子與蛋白質(zhì)作用力類(lèi)型可以根據(jù)ΔH和ΔS的值來(lái)判斷：若ΔH>0，ΔS>0，則是典型的疏水作用力；若ΔH<0，ΔS>0，則是靜電作用力；若ΔH<0，ΔS<0，則表明是氫鍵和范德華力；若ΔG<0，則表明反應(yīng)過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的。

圖4 NRG對(duì)1/T的線性關(guān)系

由表3可知，NRG-Pep結(jié)合體系的ΔH>0，ΔS>0，NRG與Pep分子間存在的相互作用力為疏水作用力。ΔG<0表明NRG與Pep的結(jié)合是自由能降低的分子作用過(guò)程，說(shuō)明NRG可以自發(fā)地與Pep相結(jié)合。

表3 NRG與Pep結(jié)合的熱力學(xué)常數(shù)

2.3.5 NRG對(duì)Pep構(gòu)象的影響

NRG對(duì)Pep構(gòu)象見(jiàn)圖5。

注：圖中Δλ=15 nm (a)，Δλ= 60 nm (b)，C (Pep) = 1.25×10-5 mol/L；圖中1～11對(duì)應(yīng)的的C (NRG) = 0、0.34、0.69、1.03、1.38、1.72、2.06、2.41、2.75、3.10、3.44×10-6 mol/L。圖5 室溫下NRG對(duì)Pep的同步熒光光譜

圖5中的a和b分別為在室溫條件下，Pep在Δλ=15 nm (酪氨酸殘基)和Δλ=60 nm (色氨酸殘基)的同步熒光光譜。隨著NRG濃度增大，Pep同步熒光強(qiáng)度逐漸降低。其中，色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度降低的幅度較大，表明Pep的熒光強(qiáng)度可能主要來(lái)自色氨酸殘基，其最大發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了藍(lán)移，表明色胺酸殘基環(huán)境的疏水性增大，Pep趨向折疊態(tài)，因此Pep的構(gòu)型發(fā)生了變化。

2.3.6 柚皮苷對(duì)胃蛋白酶紫外吸收光譜的影響

NRG與Pep反應(yīng)后在波長(zhǎng)280 nm處有最大吸收峰，加入NRG后，Pep紫外吸收光譜發(fā)生了明顯紅移，表明NRG與Pep形成了新的復(fù)合物。見(jiàn)圖6。

注：圖中C (Pep) = 1.25×10-5 mol/L，C (Pep) =C (NRG) = 1.25×10-5 mol/L; a. NRG; b. NRG-Try; c. Try; d. b-a。圖6 NRG與Pep相互作用的紫外吸收光譜

2.3.7 柚皮苷與胃蛋白酶之間的能量轉(zhuǎn)移

小分子物質(zhì)與熒光發(fā)射基團(tuán)間的能量轉(zhuǎn)移效率E和結(jié)合距離r可由公式(5)計(jì)算得出：

(5)

其中E為能量轉(zhuǎn)移效率，F(xiàn)0和F分別表示不加猝滅劑和加入猝滅劑后蛋白的熒光強(qiáng)度，R0表示轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離，r為小分子藥物與蛋白的熒光發(fā)射基團(tuán)的距離。R0可由公式(6)計(jì)算得出:

(6)

式中K2表示偶極空間取向因子，N表示介質(zhì)的折射指數(shù)，Φ表示供能體的熒光量子產(chǎn)率，J表示供能體的熒光發(fā)射光譜和受能體的紫外吸收光譜的重疊積分，可由公式(7)計(jì)算得出：

(7)

F(λ)表示供能體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度，ε(λ)表示受能體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)，K2=2/3，N=1.336，Φ=0.15；可由公式5～7式計(jì)算得出J，R0，和r值。當(dāng)供能體與受能體間的距離小于7 nm時(shí)，表明蛋白與小分子藥物之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。

供能體Pep的熒光光譜圖與受能體NRG的紫外吸收光譜圖有重疊，根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移原理，可計(jì)算出NRG在Pep上的結(jié)合位置距色氨酸殘基的距離r=2.44 nm (<7 nm)，表明Pep與NRG之間可能存在能量轉(zhuǎn)移。見(jiàn)圖7，表4。

表4 NRG與Pep間的能量轉(zhuǎn)移參數(shù)

2.3.8 柚皮苷與胃蛋白酶之間的三維熒光

三維圖a為Pep三維熒光，三維圖b為NRG-Pep三維熒光，可以看出NRG-Pep峰強(qiáng)度降低，表示了NRG和Pep之間有相互作用。見(jiàn)圖8。

圖8 胃蛋白酶和柚皮苷的三維熒光圖

3 討論

NRG能顯著猝滅Pep的熒光，熒光猝滅實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NRG與Pep的作用機(jī)制為(復(fù)合式)靜態(tài)猝滅[17]。NRG與Pep結(jié)合時(shí)約存在1個(gè)單獨(dú)的結(jié)合位點(diǎn)，即大約1個(gè)NRG分子與1個(gè)Pep分子結(jié)合形成配合物，隨著溫度的升高，結(jié)合常數(shù)也增大，37 ℃時(shí)，NRG與Pep的結(jié)合常數(shù)最大為3.40×105。通過(guò)Vant Hoff方程計(jì)算得出，NRG與Pep間的作用力類(lèi)型為疏水作用力，NRG與Pep的結(jié)合是自由能降低的分子作用過(guò)程，NRG可以自發(fā)地與Pep相結(jié)合。

根據(jù)同步熒光光譜表明，NRG在與Pep作用時(shí)，Pep構(gòu)象發(fā)生了一定程度的變化[13]。紫外吸收光譜的變化表明NRG與Pep之形成了不發(fā)光的復(fù)合物，進(jìn)而導(dǎo)致熒光吸收光譜變化，同時(shí)，F(xiàn)?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移原理表明，NRG與Pep之間存在著能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)了NRG和Pep之間存在以靜態(tài)猝滅發(fā)生相互作用的可能[18]。

通過(guò)建立植物活性成分與酶結(jié)合的體外模型，得到了兩者結(jié)合的緊密程度、結(jié)合部位、結(jié)合作用力、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等信息，不僅有助于在分子水平上認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)和藥物的相互作用，獲得藥物結(jié)合生物大分子的基本信息，還可以提供藥物藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)的相關(guān)信息。

NRG與Pep的相互作用機(jī)制可由熒光光譜的變化推斷得出，NRG與Pep產(chǎn)生了相互作用或自發(fā)結(jié)合，Pep的熒光猝滅可能是形成新的復(fù)合物引起的復(fù)合式靜態(tài)猝滅，大約1個(gè)NRG分子與1個(gè)Pep分子結(jié)合形成配合物并伴隨能量轉(zhuǎn)移。