劉海寧 張寧萍 王 平 唐文清 劉韜韜 沈錫中 方 穎

原發(fā)性肝癌(以下簡稱為肝癌)是世界范圍內(nèi)的高發(fā)腫瘤，其中70%～90%為肝細(xì)胞癌(HCC)[1]。肝癌在全球男性惡性腫瘤年發(fā)病率中居第5位，惡性腫瘤病死率中居第2位；肝癌在全球女性惡性腫瘤年發(fā)病率中居第9位，惡性腫瘤病死率中居第6位[1]。中國肝癌的發(fā)病率遠(yuǎn)高于其他國家，給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。肝癌復(fù)發(fā)是影響肝癌術(shù)后生存時間的重要因素，是肝癌切除術(shù)后致死的主要原因。對于肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的中晚期患者，目前唯一有效的靶向治療藥物索拉菲尼也只能延長約3個月的生存期[2]。因此，亟需探索肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的分子機制，以期尋找新的可早期診斷肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志物。

泛素羧基末端水解酶37(UCH37)是一種去泛素化酶，通過泛素-蛋白酶體降解途徑參與蛋白質(zhì)的降解。過氧化物酶1(PRDX1)是PRDX家族的一員，可有效消除活性氧，在氧化應(yīng)激中起著至關(guān)重要的作用。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，UCH37和PRDX1分別在肝癌組織中呈高表達(dá)和低表達(dá)，與肝癌術(shù)后預(yù)后不良相關(guān)；UCH37和PRDX1分別能促進和抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲；此外，還發(fā)現(xiàn)PRDX1與UCH37相互作用后可影響由UCH37所致的促進肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力[3-4]。c-Myc屬于Myc蛋白家族成員，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)。文獻報道，PRDX1可通過結(jié)合c-Myc的Myc 盒Ⅱ(MB Ⅱ)結(jié)構(gòu)域，特異性抑制c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮抑制腫瘤進展的作用[5-6]。本研究進一步探索UCH37與 PRDX1相互作用后通過c-Myc促進肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。小鼠抗人UCH37單克隆抗體、小鼠抗人PRDX1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗人UCH37多克隆抗體購自美國Abcam公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，蛋白酶抑制劑MG132購自德國Merck公司，BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，蛋白A-瓊脂糖購自美國Roche公司。

1.2 轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞按5×105個/孔接種于6孔板內(nèi)，待生長匯合到75%密度時，按照Lipofectamin 2000試劑盒說明書進行如下轉(zhuǎn)染。將10 μL Lipofectamine 2000滴加至90 μL無血清培養(yǎng)基中，混勻，室溫孵育5 min。將10 μL稀釋的質(zhì)粒滴加至90 μL無血清培養(yǎng)基中，混勻。將含有質(zhì)粒和Lipofectamine 2000的無血清培養(yǎng)基混勻，室溫孵育20 min。換2 mL無血清培養(yǎng)基，將Lipofectamine 2000和質(zhì)?；旌衔锛尤?孔板培養(yǎng)皿中，混勻。在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，換有血清培養(yǎng)基，并觀察熒光以確定轉(zhuǎn)染效率。48 h后收集細(xì)胞，提取蛋白行蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測。

1.3 Western blotting檢測

收集細(xì)胞前12 h，在培養(yǎng)基中加入10 μmol MG132以減少細(xì)胞蛋白降解。離心收集細(xì)胞，加適量細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，冰上預(yù)冷30 min后，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，收集細(xì)胞蛋白。用BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒對細(xì)胞蛋白進行定量分析。取適量蛋白加5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃水煮8 min，使之變性。蛋白樣品在12%的分離膠中電泳數(shù)小時后轉(zhuǎn)移到NC膜上。將膜置于5%牛奶封閉液中，在室溫下封閉1 h，置入適量一抗溶液，4 ℃孵育過夜。次日，洗膜，加入適量二抗溶液，室溫孵育1 h，放入儀器中曝光并記錄圖片。

1.4 免疫共沉淀

先對蛋白A-瓊脂糖進行預(yù)處理：將蛋白A-瓊脂糖混勻，加入1 mL 1×PBS，4 ℃ 3 000 r/min離心2 min，棄去上清，重復(fù)3次。收集細(xì)胞蛋白，加入適量一抗溶液，4 ℃旋轉(zhuǎn)10 h。加入適量已預(yù)處理的蛋白A-瓊脂糖，4 ℃旋轉(zhuǎn)過夜。次日將混合物于4 ℃ 3 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)3次，最終獲得免疫共沉淀的沉淀物，用于Western blotting檢測。

1.5 細(xì)胞免疫熒光及激光共聚焦實驗

在24孔板中接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，用1×PBS輕輕洗1遍。將預(yù)先混合好并冰浴的丙酮、甲醇混合液(以體積1∶1混合)加入細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，室溫放置2 min，吸棄混合液，用1×PBS輕輕洗3遍。在細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，加入溶于1×PBS的5%胎牛血清溶液，37 ℃恒溫箱中封閉1 h。PBS-T(1×PBS中加入0.2% Triton X-100)沖洗3次，加入適量一抗溶液，4 ℃孵育過夜。加入不同熒光標(biāo)記的二抗溶液，37 ℃恒溫箱中避光孵育1 h。用DAPI溶液進行細(xì)胞核染色，PBS-T洗滌3次。取出蓋玻片，用熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 UCH37高表達(dá)后PRDX1與c-Myc的結(jié)合情況

在本課題組的前期研究中，免疫共沉淀和激光共聚焦結(jié)果已證實UCH37與PRDX1之間存在相互作用[4]。本研究中探討了UCH37、PRDX1和c-Myc之間的關(guān)系。免疫共沉淀結(jié)果顯示UCH37與c-Myc、PRDX1與c-Myc之間存在相互結(jié)合(圖1A、1B)，激光共聚焦結(jié)果顯示UCH37和c-Myc共定位于細(xì)胞核內(nèi)(圖1C)。隨后，在6孔板中種植293T細(xì)胞，待細(xì)胞長至75%密度時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。第1個孔轉(zhuǎn)染PRDX1質(zhì)粒3 μg，第2個孔轉(zhuǎn)染PRDX1質(zhì)粒3 μg和c-Myc質(zhì)粒2 μg，第3、4、5個孔在轉(zhuǎn)染PRDX1質(zhì)粒3 μg和c-Myc質(zhì)粒2 μg的基礎(chǔ)上再分別轉(zhuǎn)染UCH37質(zhì)粒1 μg、3 μg和6 μg。通過PRDX1抗體進行免疫共沉淀，檢測與其結(jié)合的c-Myc強度，結(jié)果顯示隨著UCH37轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量的梯度增高，用相同量的PRDX1進行免疫共沉淀后，與PRDX1結(jié)合的c-Myc蛋白表達(dá)量逐漸降低(圖1B)。

注：Flag為融合了Flag標(biāo)簽蛋白；HA為融合了HA標(biāo)簽蛋白；IP為免疫共沉淀；IB為蛋白質(zhì)印跡；WCL為全細(xì)胞溶解；s.e.為短時間曝光；l.e.為長時間曝光

2.2 UCH37高表達(dá)后PRDX1的表達(dá)情況

在上述實驗中獲取的細(xì)胞總蛋白行Western blotting檢測，結(jié)果顯示，隨著UCH37的梯度表達(dá)增高， PRDX1蛋白表達(dá)量逐漸降低(圖2A)。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育調(diào)控蛋白4(NEDD4)蛋白屬于含HECT結(jié)構(gòu)域的泛素E3連接酶。本研究通過免疫共沉淀及激光共聚焦技術(shù)，發(fā)現(xiàn)UCH37與NEDD4之間存在相互作用(圖2B、2C)。此外，還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NEDD4后，PRDX1的泛素化水平明顯增高(圖2D)。由此可見，UCH37高表達(dá)后，通過NEDD4對PRDX1泛素化降解增加而使其呈低表達(dá)。

注：Input為陽性對照；CTRL為陰性對照

2.3 UCH37高表達(dá)后細(xì)胞核內(nèi)c-Myc蛋白表達(dá)情況

本研究進一步探討了c-Myc在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。激光共聚焦結(jié)果顯示，PRDX1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)，c-Myc主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，兩者共定位于細(xì)胞核內(nèi)(圖3A)。在6孔板中種植293T細(xì)胞，待細(xì)胞長至75%密度時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。每個孔都轉(zhuǎn)染PRDX1質(zhì)粒3 μg，第1個孔未轉(zhuǎn)染UCH37質(zhì)粒，第2、3、4個孔分別轉(zhuǎn)染UCH37質(zhì)粒2 μg、4 μg和8 μg。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用試劑盒分離細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白分別行Western blotting檢測(圖3B)。結(jié)果顯示，c-Myc主要在細(xì)胞核中，細(xì)胞質(zhì)中基本沒有表達(dá)。此外，隨著UCH37的梯度表達(dá)增高，細(xì)胞核內(nèi)c-Myc蛋白表達(dá)量逐漸增高。

3 討論

依賴泛素的蛋白質(zhì)降解途徑(UPP)可選擇性地降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，是一條重要的非溶酶體蛋白降解途徑，對蛋白質(zhì)翻譯后修飾和降解起著關(guān)鍵作用[7-9]。UCH37是一種去泛素化酶。目前關(guān)于UCH37發(fā)揮去泛素化酶作用的機制研究得較為深入，即UCH37和26S蛋白酶體的一個亞基hRpn13通過C末端共同的KEKE模序，將UCH37富集到26S蛋白酶體的表面，解除UCH37自主抑制作用，從而激活其去泛素化酶的活性[10]。然而，關(guān)于UCH37在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、作用的底物蛋白、細(xì)胞功能等方面的研究較少。有文獻報道，UCH37可上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)通路[11]；可能通過與人Ino80染色質(zhì)重塑復(fù)合物(hINO80)結(jié)合發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用[12]；通過Wnt通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。UCH37在腫瘤中的作用研究甚少。

圖3 c-Myc的表達(dá)情況 A PRDX1與c-Myc的激光共聚焦結(jié)果 ×400 B UCH37梯度表達(dá)增高后c-Myc表達(dá)變化

本課題組前期開展了UCH37與肝癌之間關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)UCH37在肝癌組織中呈高表達(dá)，并且是肝癌術(shù)后無瘤生存的獨立危險因素；體外實驗結(jié)果顯示，UCH37可促進肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[3]。此外，應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)，在肝癌組織中分離和富集了與UCH37相互作用的蛋白質(zhì)；對免疫共沉淀產(chǎn)物進行雙向電泳，聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)及高效的數(shù)據(jù)庫搜索手段，篩選出27種與UCH37相互作用的蛋白質(zhì)。同時應(yīng)用原核細(xì)胞表達(dá)、純化蛋白的技術(shù)，在體外得到了純化的GST-UCH37融合蛋白，將此融合蛋白與Huh7細(xì)胞總蛋白進行GST pull-down實驗，對沉淀產(chǎn)物行SDS-PAGE電泳，聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)及高效的數(shù)據(jù)庫搜索手段，篩選出63種與UCH37相互作用的蛋白質(zhì)。分析兩組結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了一種共同的蛋白質(zhì)PRDX1。

PRDX1是過氧化物酶家族成員，主要分布在細(xì)胞質(zhì)，具有清除體內(nèi)生物活性氧[14]、調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15-16]和分子伴侶[17]等功能。有研究顯示，PRDX1在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等組織中均呈高表達(dá)[18-23]，與預(yù)后不良相關(guān)[24-27]；PRDX1基因敲除能增強化學(xué)治療藥物的效果[28]。然而，另有研究顯示PRDX1是一種抑癌因子，在腫瘤組織中呈低表達(dá)，可抑制腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移[29-30]。

鑒于PRDX1在肝癌中發(fā)揮促癌還是抑癌作用尚未明確，本課題組就PRDX1在肝癌組織中的表達(dá)情況及其對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRDX1在肝癌組織中呈低表達(dá)，且是肝癌術(shù)后無瘤生存和總體生存的獨立危險因素；體外實驗結(jié)果顯示，PRDX1可抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[4]。

文獻報道，PRDX1通過結(jié)合癌蛋白c-Myc的MB Ⅱ結(jié)構(gòu)域，特異性抑制c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)c-Myc靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其抑癌基因的特性[5-6]。c-Myc屬于Myc蛋白家族成員，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。正常細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)c-Myc，惡性腫瘤細(xì)胞中c-Myc呈異常高表達(dá)，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、髓性白血病、黑色素瘤、骨肉瘤、惡性膠質(zhì)瘤、小細(xì)胞肺癌及成神經(jīng)管細(xì)胞瘤[31-33]。近年來有研究表明，c-Myc在肝癌組織中同樣發(fā)揮促腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用，并開始探索針對Myc的靶向治療藥物[34]。對其進一步的分子機制研究顯示，c-Myc具有促進腫瘤細(xì)胞增殖、抑制干細(xì)胞分化、促進腫瘤血管生成、促進腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、干擾腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。在細(xì)胞內(nèi)，c-Myc通過促進或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用：一方面，c-Myc通過促進CDC25A、周期素依賴性蛋白激酶4(CDK4)、細(xì)胞周期蛋白D2(Cyclin D2)、Cyclin E、Cyclin A等細(xì)胞周期相關(guān)生長因子的表達(dá)，促進細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化；另一方面，c-Myc通過抑制特異性生長阻滯基因1(GAS1)、p15、p21、p27、生長阻滯及DNA損壞基因(GADD)等生長抑制基因，解除生長抑制基因?qū)?xì)胞無限生長的抑制，進而促進細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化[35-40]。此外，c-Myc能夠調(diào)控miRNA，也受miRNA調(diào)控[41]。有研究發(fā)現(xiàn)，c-Myc通過泛素/蛋白酶體通路進行降解[42]?；谏鲜鲅芯砍晒捅菊n題組前期的研究基礎(chǔ)，我們提出假設(shè)并驗證，即UCH37高表達(dá)后通過與PRDX1結(jié)合，使PRDX1與c-Myc結(jié)合減少，釋放出c-Myc聚集在細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮促進腫瘤進展的作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)UCH37高表達(dá)后通過以下兩個方面發(fā)揮促進肝癌發(fā)生、發(fā)展的作用(圖4)：首先，UCH37高表達(dá)后對PRDX1泛素化降解增加而使其呈低表達(dá)，而在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)PRDX1在肝癌中是一個抑癌因子，發(fā)揮著抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用；其次，隨著UCH37的梯度表達(dá)增高，用相同量的PRDX1進行免疫共沉淀后，與PRDX1結(jié)合的c-Myc蛋白逐漸減少，同時細(xì)胞核內(nèi)c-Myc蛋白逐漸增多，表明釋放出的c-Myc聚積在細(xì)胞核中，發(fā)揮其促進腫瘤進展的作用。因此，UCH37高表達(dá)后通過降低抑癌因子PRDX1的表達(dá)和增高促癌因子c-Myc的表達(dá)，從而發(fā)揮促進肝癌發(fā)生、發(fā)展的作用。在既往研究中，本課題組在肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞中構(gòu)建UCH37與PRDX1過表達(dá)和下調(diào)的穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株，從中探索UCH37、PRDX1與肝癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系[3-4]，由于本研究只是初步探索UCH37通過PRDX1促進肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，只在293T細(xì)胞中進行了研究，今后將拓展至肝癌細(xì)胞系中進行深入研究。

圖4 UCH37通過PRDX1影響c-Myc表達(dá)的作用機制

綜上所述，本研究顯示，UCH37高表達(dá)后對PRDX1泛素化降解增加而使其呈低表達(dá)，同時UCH37通過與PRDX1結(jié)合使PRDX1與c-Myc結(jié)合減少，釋放出c-Myc聚集在細(xì)胞核內(nèi)，從而發(fā)揮促進肝癌進展的作用。此研究結(jié)論為肝癌發(fā)生、發(fā)展的機制研究提供了新的思路。