安紅杰 耿 華 葛志勝 徐金鳳 何文艷 趙崇山 高美麗 陳俊紅

慢性乙型肝炎(CHB)患者隨病程進(jìn)展多伴有肝纖維化[1]。肝纖維化是CHB病程進(jìn)展的重要病理過(guò)程，若不及時(shí)進(jìn)行干預(yù)，易發(fā)展為肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌[2]。中國(guó)每年約有60萬(wàn)人因CHB肝硬化及肝細(xì)胞癌死亡[3]。探究肝纖維化的發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制對(duì)于抑制肝纖維化進(jìn)展尤為重要。已有多項(xiàng)研究表明肝纖維化與肝星狀細(xì)胞激活有關(guān)[4-6]。HBV誘發(fā)肝損傷可激活肝星狀細(xì)胞，增加細(xì)胞外基質(zhì)分泌，還可誘使活化的肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生及進(jìn)展。早期了解肝纖維化程度并及時(shí)進(jìn)行干預(yù)可有效抑制肝纖維化進(jìn)展[7-9]。目前，肝穿刺活組織檢查是確診肝纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)[10]，但由于其為有創(chuàng)傷性檢查，且檢查耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于臨床廣泛應(yīng)用。因此，需探究便利、準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物或檢查手段以評(píng)估肝纖維化程度。

10-11轉(zhuǎn)位酶3(TET3)是一種DNA去甲基化酶，可將5-甲基胞嘧啶氧化為5-羥甲基胞嘧啶[11]。有研究表明，TET3可靶向長(zhǎng)鏈非編碼RNA HIF1A-AS1介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化[12]；此外，TET3/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的正反饋回路可促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展[13]。由此推測(cè)TET3參與了肝纖維化的進(jìn)展過(guò)程，其表達(dá)水平與肝纖維化程度有關(guān)。外周血單個(gè)核細(xì)胞可反映肝纖維化程度，且在外周血中含量較高，易于采集[14]。本文探究了CHB肝纖維化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3水平與肝纖維化程度的關(guān)系，以期為評(píng)估肝纖維化程度提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年9月至2019年12月在河北中石油中心醫(yī)院確診的137例CHB肝纖維化患者作為研究對(duì)象。根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[14]診斷CHB。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受肝穿刺活組織病理檢查，并診斷為肝纖維化；(2)未接受抗病毒和抗纖維化治療；(3)能夠配合完成相關(guān)檢查；(4)簽署了知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并自身免疫性肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝炎或非酒精性脂肪性肝病等；(2)合并肝細(xì)胞癌；(3)除HBV感染之外，合并其他嚴(yán)重感染性疾病。137例CHB肝纖維化患者中男性85例，女性52例，年齡20～66歲，平均年齡為(45.78±11.02)歲；其中S1期28例，S2期36例，S3期30例，S4期43例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)KYLL-2019-06)。

1.2 臨床信息收集及處理

收集年齡、性別等信息，使用7600型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)檢測(cè)肝穿刺活組織檢查前1日或當(dāng)日AST和ALT水平，使用DxH 600血細(xì)胞分析儀[貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(蘇州)有限公司]檢測(cè)血小板(PLT)水平。計(jì)算AST/PLT比值指數(shù)(APRI)和肝纖維化指數(shù)(FIB-4)，APRI=AST(/正常值上限，U/L)/PLT(×109/L)×100，F(xiàn)IB-4=年齡×AST(U/L)/[PLT(×109/L)×ALT(U/L)1/2]。

1.3 肝纖維化程度判斷

超聲引導(dǎo)下將活組織穿刺針插入CHB肝纖維化患者肝部，取出約2 cm的肝組織，由本院病理科2名副主任醫(yī)師評(píng)估肝纖維化程度。肝纖維化程度分為S1期、S2期、S3期和S4期。S1期 匯管區(qū)肝纖維化擴(kuò)大，局限竇周或肝小葉內(nèi)纖維化；S2期 肝匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，但肝小葉結(jié)構(gòu)保留；S3期 纖維間隔及肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，但未進(jìn)展至肝硬化；S4期 肝硬化[14]。

1.4 外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3表達(dá)水平檢測(cè)

抽取CHB肝纖維化患者肝穿刺活組織檢查前1日或當(dāng)日的空腹肘部靜脈血10 mL，采用密度梯度離心法提取外周血中單個(gè)核細(xì)胞[15]。步驟如下：25 ℃ 800 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm，取離心后下層血細(xì)胞，置入10 mL Ficoll分離液中，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞。

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平[16]。步驟如下：取上述實(shí)驗(yàn)獲取的外周血單個(gè)核細(xì)胞，滴加RIPA裂解液至裝有單個(gè)核細(xì)胞的試管中，裂解細(xì)胞，獲取總蛋白，然后使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。80 V凝膠電泳15 min，然后加壓至120 V，直至溴酚藍(lán)跑出膠面，轉(zhuǎn)膜，然后用5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加兔抗人TET3單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，滴加二抗，室溫下孵育2 h。采用電化學(xué)發(fā)光法(ELC)曝光顯影。應(yīng)用ImageJ 1.8.0軟件讀取蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)的條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組基本資料比較

S1期、S2～S3期和S4期患者在年齡、性別方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；在AST、ALT、PLT、APRI指數(shù)和FIB-4指數(shù)方面比較，3組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。S4期AST水平、APRI指數(shù)和FIB-4指數(shù)均高于S1期和S2～S3期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。S4期ALT水平高于S1期，PLT水平低于S1期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。S2～S3期AST、ALT和APRI指數(shù)均高于S1期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組基本資料比較

2.2 各組TET3水平比較

S1期、S2～S3期和S4期外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3水平分別為2.17±0.71、3.39±1.18和5.75±1.40，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=89.023，P<0.001)。S4期外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3水平高于S1期和S2～S3期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。S2～S3期外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3水平高于S1期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 TET3水平與肝纖維化程度的關(guān)系

外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3水平與肝纖維化病理分期呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.811，P<0.001)。

圖1 TET3與肝纖維化病理分期的散點(diǎn)圖

2.4 TET3診斷肝纖維化程度的效能

外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3診斷≥S2期、≥S3期和S4期的AUC分別為0.873、0.940和0.930，均大于APRI指數(shù)和FIB-4指數(shù)的AUC，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[APRI(Z=2.037，P=0.042；Z=4.560，P<0.001；Z=3.161，P<0.001)，F(xiàn)IB-4(Z=3.124，P=0.002；Z=5.976，P<0.001；Z=4.670，P<0.001)]。見(jiàn)表2、圖2。

表2 TET3診斷肝纖維化程度的效能比較

圖2 TET3診斷肝纖維化程度的ROC曲線 A 肝纖維化程度≥S2期 B 肝纖維化程度≥S3期 C 肝纖維化程度為S4期

3 討論

研究表明，下調(diào)DJ-1蛋白表達(dá)可降低肝細(xì)胞、肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞氧自由基水平，同時(shí)減少中性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制肝纖維化進(jìn)展[17]。及時(shí)了解CHB患者肝纖維化程度并進(jìn)行干預(yù)，對(duì)于改善患者預(yù)后意義重大。肝臟病理學(xué)活組織檢查是評(píng)價(jià)肝纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其為有創(chuàng)性檢查，難以動(dòng)態(tài)評(píng)估肝纖維化程度；此外，若取樣不足，無(wú)法進(jìn)行評(píng)估[18]。瞬時(shí)彈性成像技術(shù)是無(wú)創(chuàng)性評(píng)估肝纖維化程度的方法之一，具有較高的價(jià)值[19]，但對(duì)有腹水、肥胖或肋間隙較小的患者，其評(píng)估結(jié)果的效能較低[20]；此外，該檢查費(fèi)用較高，對(duì)于操作技術(shù)也有一定要求，因此臨床大規(guī)模應(yīng)用受限。

TET3在人肝纖維化組織和小鼠肝纖維化組織中均高表達(dá)。TET3/TGF-β1的正反饋回路不僅可促使肝星狀細(xì)胞表達(dá)纖維化相關(guān)基因，還可誘使肝細(xì)胞大量表達(dá)TGF-β1，促進(jìn)了肝纖維化的進(jìn)展。有研究表明，抑制TET3表達(dá)，可改善四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化[13]。由此推測(cè)，TET3可通過(guò)上述機(jī)制參與CHB患者肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，檢測(cè)其在外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平有望評(píng)估肝纖維化程度。

本研究比較了S1期、S2～S3期和S4期患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示S4期外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平高于S1期和S2～S3期，S2～S3期外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平高于S1期，表明隨CHB肝纖維化程度加重，外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平也隨之升高，提示外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平與肝纖維化關(guān)系密切。隨后，本研究進(jìn)一步分析了CHB肝纖維化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平與肝纖維化程度的關(guān)系，結(jié)果顯示外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平與肝纖維化病理分期呈正相關(guān)，提示檢測(cè)CHB肝纖維化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平有助于評(píng)估肝纖維化程度。

APRI指數(shù)和FIB-4指數(shù)的計(jì)算較為簡(jiǎn)便，相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)費(fèi)用也較為低廉，已被歐洲肝病指南推薦為評(píng)估慢性丙型肝炎肝纖維化的指標(biāo)，尤其適用于醫(yī)療技術(shù)不發(fā)達(dá)的地區(qū)[21]。多項(xiàng)研究表明，APRI指數(shù)和FIB-4指數(shù)對(duì)于評(píng)估CHB肝纖維化程度具有較高價(jià)值[22-23]。本文構(gòu)建了TET3、APRI指數(shù)和FIB-4指數(shù)診斷肝纖維化程度≥S2期、≥S3期和S4期的ROC曲線，結(jié)果顯示外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3診斷≥S2期、≥S3期和S4期的AUC分別為0.873、0.940和0.930，均大于APRI指數(shù)和FIB-4指數(shù)的AUC，提示外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平可輔助評(píng)估CHB肝纖維化程度。

綜上所述，CHB肝纖維化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平與肝纖維化程度關(guān)系密切。CHB肝纖維化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平越高，提示肝纖維化程度越嚴(yán)重。檢測(cè)CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TET3的表達(dá)水平可輔助評(píng)估肝纖維化程度，有利于臨床動(dòng)態(tài)評(píng)估抗纖維化治療方案的療效。本研究的不足之處在于為單中心研究，納入樣本均為同一地區(qū)患者，為避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成偏倚，今后還需進(jìn)一步開(kāi)展多中心、跨地域的深入研究。