王慧敏，蔡施霞，周 震，隋 娜

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東青島 266003)

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由休克、吸入有害氣體、感染、創(chuàng)傷等心源性之外的因素引起的彌漫性的肺損傷，主要表現(xiàn)為肺泡水腫、肺組織炎癥等[1]。KONG等[2]研究顯示，感染尤其是革蘭氏陰性菌感染是常見的引起急性肺損傷/ARDS的原因之一。脂多糖((lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的致病成分，其可以誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷，激活細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌。肺泡上皮細(xì)胞是急性肺損傷發(fā)生的靶細(xì)胞。lncRNA是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點，其長度一般大于200 nt，沒有編碼蛋白質(zhì)的作用，可以通過和miRNA作用發(fā)揮功能[3]。很多研究表明，lncRNA不僅參與細(xì)胞生長、胚胎發(fā)育，還與很多疾病的進(jìn)展有關(guān)[4]。既往實驗研究顯示，lncRNA在肺組織損傷中的表達(dá)發(fā)生改變，而且lncRNA還和肺損傷程度有關(guān)[5]。lncRNA XIST來自于X-非特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤、皮膚損傷、心肌肥大等疾病中發(fā)揮作用[6]。以前的研究發(fā)現(xiàn)，XIST還參與肺組織損傷，XIST在肺炎中高表達(dá)，并且敲低XIST抑制肺組織炎癥[7]。原發(fā)性移植物功能障礙屬于常見的急性肺損傷，XIST能夠加速原發(fā)性移植物功能障礙的發(fā)生，而下調(diào)XIST可能是治療原發(fā)性移植物功能障礙的途徑之一[8]。前期的預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，XIST和miR-150有互補結(jié)合位點。以前的研究證實，miR-150在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷以及肺泡上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮抑制功能[9]。目前尚未見關(guān)于XIST靶向miR-150在LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞中的作用探討。本實驗以小鼠肺上皮MLE-12細(xì)胞為體外研究對象，以LPS構(gòu)建體外急性肺損傷細(xì)胞模型，探討XIST靶向miR-150在急性肺損傷中的可能作用，旨在為基因治療急性肺損傷提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料XIST shRNA、shRNA control、miR-150 inhibitor、inhibitor control、WT和MUT均由北京吉田生物科技有限公司構(gòu)建；IL-1β含量檢測試劑盒購自上海滬震實業(yè)有限公司；小鼠肺上皮MLE-12細(xì)胞購自上海復(fù)祥生物科技有限公司；LPS購自美國Sigma；SOD活性檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；引物由金唯智生物科技有限公司合成；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen；ROS檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；TNF-α含量檢測試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司。

1.2 實驗分組及處理MLE-12細(xì)胞用含有100 U/mL青鏈霉素以及100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。細(xì)胞生長至對數(shù)期以后，將MLE-12細(xì)胞分成4組，分別為：Control、LPS、sh-NC+LPS、sh-XIST+LPS，Control組為不做處理的對照細(xì)胞，LPS、sh-NC+LPS、sh-XIST+LPS組細(xì)胞分別在實驗開始時用含有1 μg/mL的LPS細(xì)胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)24 h。sh-NC+LPS、sh-XIST+LPS組細(xì)胞在用LPS處理以前，分別用Lipofectamine 2000在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染shRNA control、XIST shRNA。細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法均按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000操作進(jìn)行。

1.3 qRT-PCR檢測XIST表達(dá)用Trizol試劑抽提細(xì)胞中的總RNA，然后取2 μg的RNA，進(jìn)行cDNA合成反應(yīng)。首先在RNA中添加1 μL的oligo(dT)，然后用DEPC水補足到12 μL，放在PCR儀上，以70 ℃孵育5 min，然后放在冰上冷卻。再分別吸取2 μL的dNTPs、5 μL的5×Buffer、1 μL的反轉(zhuǎn)錄酶、1 μL的RNA inhibitor，用移液槍反復(fù)吹打混合以后，放在42 ℃孵育60 min，80 ℃孵育5 min，將獲取的cDNA放在―20 ℃保存。PCR反應(yīng)的引物為：內(nèi)參GAPDH上游(5′-3′)TTCCTACCCCAATGTATCCG，下游(5′-3′)CATGAGGTCCACCACCCTGTT，XIST上游(5′-3′)CCAAGCTTTGCACACGGCCTATCTCATC，下游(5′-3′)CCGCTCG-

AGTGAAAAGAGGTGGGGCATCC。PCR反應(yīng)體系：2 μL的引物、12.5 μL的2×qPCR mix、2.5 μL的cDNA，然后添加ddH2O至25 μL。PCR條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60℃ 60 s，根據(jù)2-△△Ct法分析XIST表達(dá)水平。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡收集各組細(xì)胞，在細(xì)胞中加入PBS溶液洗滌2次，然后將細(xì)胞懸浮在400 μL的Binding Buffer中，吸取5 μL的Annexin V-FITC和PI染色液添加到細(xì)胞內(nèi)，混合以后，放在室溫中，避光反應(yīng)15 min。用流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 Western blotting檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)添加RIPA裂解溶液，晃動細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使裂解溶液與細(xì)胞完全接觸，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放在冰上充分裂解30 min，吹打幾次以后，將裂解以后的細(xì)胞碎片轉(zhuǎn)移到離心管中，然后設(shè)置10 000 g離心10 min。吸取上清溶液，用BCA方法檢測濃度以后，置于―80 ℃保存。在蛋白中添加5×Loading Buffer混合以后，放在100 ℃煮沸5 min。制備100 g/L的分離膠以及50 g/L的濃縮膠。在上樣孔中按照30 μg蛋白/孔添加樣品，設(shè)置100 V的電壓在濃縮膠中電泳，觀察到溴酚藍(lán)進(jìn)入到分離膠之后，把電壓調(diào)整為120 V繼續(xù)電泳。電泳2 h以后，觀察到溴酚藍(lán)已經(jīng)跑到玻璃板的下端，關(guān)閉電源。把裁剪以后的NC膜以及分離膠浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡。設(shè)置70 V的電壓進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜需要在冰上進(jìn)行，轉(zhuǎn)膜50 min以后，關(guān)閉電源。將NC膜放在封閉液中，于室溫中結(jié)合2 h，然后將NC膜放在稀釋以后的一抗溶液(按照1∶1 000稀釋)中，將抗體孵育裝置放在4 ℃反應(yīng)過夜后，于二抗稀釋液(按照1∶2 000稀釋)中室溫結(jié)合2 h。按照ECL顯色試劑盒顯色，分析條帶的灰度值。GAPDH設(shè)置為內(nèi)參，分析目的蛋白的表達(dá)變化。

1.6 MDA、SOD、ROS水平的檢測收集各組細(xì)胞，利用TBA法檢測MDA含量，利用黃嘌呤氧化法檢測SOD活性，利用DCFH-DA法檢測ROS水平(結(jié)果以相對熒光強度表示)，步驟均按照MDA含量檢測試劑盒、SOD活性檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 IL-1β、TNF-α水平的檢測收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，利用ELISA法分析 IL-1β、TNF-α水平，步驟均按照IL-1β含量檢測試劑盒和TNF-α含量檢測試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.8 靶基因預(yù)測和鑒定利用生物信息學(xué)軟件Starbase分析XIST的可能靶基因(miR-150)，然后利用熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定二者的靶向關(guān)系。將WT和MUT分別和miR-150 mimics、mimics control共轉(zhuǎn)染到MLE-12細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h以后，用熒光素酶活性測定試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性變化。WT為含有XIST結(jié)合位點的野生型熒光素酶報告載體，MUT為含有突變以后的XIST結(jié)合位點的突變型熒光素酶報告載體。收集Control、LPS、sh-NC+LPS、sh-XIST+LPS組細(xì)胞，用qRT-PCR方法分析細(xì)胞中miR-150的表達(dá)變化，內(nèi)參為U6。引物序列為：U6上游(5′-3′)GCTTCGGCAGCACATAT-

ACTAAAT，下游(5′-3′)CGCTTCACGAATTTGCGTGTCATT；miR-150上游(5′-3′)GCTCTCCCAACCCTTGTC，下游(5′-3′)TGCGTGTCGTGGAGTC。

1.9 逆轉(zhuǎn)實驗在MLE-12細(xì)胞中分別將XIST shRNA、miR-150 inhibitor和XIST shRNA、inhibitor control共轉(zhuǎn)染，然后用1 μg/mL的LPS細(xì)胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)24 h，記為sh-XIST+Anti-miR-150+LPS、sh-XIST+Anti-miR-NC+LPS組。收集細(xì)胞，按照上述方法檢測細(xì)胞凋亡(參照1.4項)和Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)(參照1.5項)以及MDA、SOD、ROS水平(參照1.6項)和分泌IL-1β、TNF-α水平(參照1.7項)。

2 結(jié) 果

2.1 XIST shRNA對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞中XIST表達(dá)的影響與Control組比較，LPS組MLE-12細(xì)胞中XIST水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與sh-NC+LPS組比較，sh-XIST+LPS組MLE-12細(xì)胞中XIST水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示，XIST shRNA降低了LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞中XIST表達(dá)水平(表1)。

表1 XIST shRNA轉(zhuǎn)染對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞中XIST水平的影響

2.2 下調(diào)XIST對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡的影響與Control組比較，LPS組MLE-12細(xì)胞凋亡率升高，Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與sh-NC+LPS組比較，sh-XIST+LPS組MLE-12細(xì)胞凋亡率降低，Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示，下調(diào)XIST減弱LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡作用(圖1，表2)。

圖1 下調(diào)XIST對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡以及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表2 XIST shRNA轉(zhuǎn)染對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

2.3 下調(diào)XIST對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞氧化損傷的影響與Control組比較，LPS組MLE-12細(xì)胞中ROS和MDA水平升高，SOD水平降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與sh-NC+LPS組比較，sh-XIST+LPS組MLE-12細(xì)胞中ROS和MDA水平降低，SOD水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示，下調(diào)XIST減弱LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞氧化損傷(表3)。

表3 XIST shRNA轉(zhuǎn)染對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞ROS、SOD、MDA水平的影響

2.4 下調(diào)XIST對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞炎癥因子分泌的影響與Control組比較，LPS組MLE-12細(xì)胞分泌的IL-1β、TNF-α增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與sh-NC+LPS組比較，sh-XIST+LPS組MLE-12細(xì)胞分泌的IL-1β、TNF-α減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示，下調(diào)XIST減弱LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞炎癥因子分泌(表4)。

表4 XIST shRNA轉(zhuǎn)染對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α水平的影響

2.5 下調(diào)XIST靶向促進(jìn)miR-150的表達(dá)生物信息學(xué)軟件預(yù)測XIST和miR-150結(jié)合位點見圖2，熒光素酶報告系統(tǒng)顯示，miR-150 mimics和WT共轉(zhuǎn)染以后的細(xì)胞熒光素酶活性降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表5)。與Control組比較，LPS組MLE-12細(xì)胞中miR-150水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與sh-NC+LPS組比較，sh-XIST+LPS組MLE-12細(xì)胞中miR-150水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示，下調(diào)XIST提高LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞中miR-150的表達(dá)(表6)。

表5 熒光素酶活性

表6 XIST shRNA轉(zhuǎn)染對LPS誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞中miR-150表達(dá)的影響

圖2 XIST和miR-150結(jié)合位點示意圖

2.6 miR-150 inhibitor逆轉(zhuǎn)下調(diào)XIST影響LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡、炎癥因子分泌和氧化損傷的功能與sh-XIST+Anti-miR-NC+LPS組比較，sh-XIST+Anti-miR-150+LPS組MLE-12細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)增多，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞分泌的IL-1β、TNF-α增多，細(xì)胞中SOD水平降低，ROS和MDA水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3，表7)。

圖3 miR-150 inhibitor逆轉(zhuǎn)在下調(diào)XIST時對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡以及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表7 miR-150 inhibitor和XIST shRNA轉(zhuǎn)染對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)以及ROS、SOD、MDA和分泌IL-1β、TNF-α水平的影響

與sh-XIST+Anti-miR-NC+LPS組比較，*P<0.05。

3 討 論

急性肺損傷/ARDS是臨床上常見疾病，創(chuàng)傷、休克等多種因素都可以誘導(dǎo)肺損傷的發(fā)生，而感染誘發(fā)的急性肺損傷/ARDS最為常見[10]。LPS是誘導(dǎo)急性肺損傷的常見誘導(dǎo)因子，其可以促進(jìn)肺組織炎癥和氧化損傷[11]。在急性肺損傷發(fā)生過程中，肺泡上皮細(xì)胞過度凋亡、分泌大量的炎癥因子以及氧化損傷等是導(dǎo)致肺功能障礙的重要原因[12]。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)少量的ROS具有維持機(jī)體氧化平衡以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，而當(dāng)受到外界因素刺激以后，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性降低，導(dǎo)致ROS不能被降解，過量的ROS可以激活細(xì)胞凋亡蛋白，誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，同時也可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，造成氧化損傷[13]。SOD是一種抗氧化酶，其可以降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平[14]。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化的產(chǎn)物，其表達(dá)水平的高低與氧化損傷程度有關(guān)[15]。Bcl-2是細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白，其含有多個蛋白成員，分別在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮不同作用，常見的促凋亡蛋白有Bax等，抗凋亡蛋白有Bcl-2等[16]。IL-1β、TNF-α是常見的促炎因子，其表達(dá)升高后誘導(dǎo)組織炎癥損傷[17]。也有研究表明，ROS可以促進(jìn)炎癥發(fā)生[18]。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激以后的MLE-12細(xì)胞凋亡水平升高，細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，ROS和MDA水平升高，SOD活性降低，細(xì)胞分泌的IL-1β、TNF-α增多，說明LPS誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞損傷，成功構(gòu)建了急性肺損傷體外細(xì)胞模型。

lncRNA作為現(xiàn)階段生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，其在疾病靶向基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景[19]。lncRNA沒有編碼蛋白質(zhì)的功能，其可以通過作用于下游基因的表達(dá)而發(fā)揮復(fù)雜的生物學(xué)作用[20]。研究報道顯示，急性肺損傷受到lncRNA的調(diào)控作用，而且lncRNA還與肺組織損傷的程度有關(guān)[21]。目前有關(guān)于XIST在癌癥中的研究較多，其通過調(diào)控癌癥細(xì)胞的凋亡、生長等發(fā)揮促進(jìn)癌癥進(jìn)展的作用[22]。在肺組織損傷中發(fā)現(xiàn)，XIST在肺組織炎癥中高表達(dá)，并且下調(diào)XIST可以抑制肺組織炎癥，減少肺組織中細(xì)胞凋亡水平[7]。原發(fā)性移植物功能障礙是急性肺損傷中的一種，下調(diào)XIST能夠有效減緩原發(fā)性移植物功能障礙的發(fā)生[8]。本研究表明，LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞中XIST高表達(dá)，并且下調(diào)XIST抑制LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡、氧化損傷和炎癥因子分泌，提示XIST可能在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中發(fā)揮促進(jìn)作用，而下調(diào)XIST有抵抗急性肺損傷的功能。

miRNA是lncRNA發(fā)揮生物學(xué)作用的下游靶基因，lncRNA通過與miRNA結(jié)合發(fā)揮多重作用[23-24]。miR-150是一個在急性肺損傷/ARDS中表達(dá)下調(diào)的調(diào)節(jié)因子，上調(diào)miR-150可抑制LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型炎癥水平，降低LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌[9]。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)XIST靶向促進(jìn)miR-150的表達(dá)，并且miR-150在LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，下調(diào)miR-150逆轉(zhuǎn)下調(diào)XIST對LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡、氧化損傷和炎癥因子分泌的作用，這提示下調(diào)XIST作用機(jī)制與miR-150有關(guān)。

總之， XIST可能是一種急性肺損傷促進(jìn)因子，下調(diào)XIST能夠在體外抑制LPS誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞凋亡、氧化損傷和炎癥因子分泌，并且其機(jī)制與靶向上調(diào)miR-150有關(guān)。這為研究急性肺損傷分子發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為靶向基因治療急性肺損傷提供了新方向。本研究尚未涉及miRNA-150的靶蛋白，后續(xù)實驗將對此進(jìn)行深入探究。