張加強(qiáng),陸 群,趙 昱

(1.西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 成都 610031;2.云南省藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用工程實驗室,云南 大理 671000)

(R)-1-(4-溴苯基)乙胺是許多具有藥物活性和生物活性化合物的重要合成中間體,例如可以用于合成新型廣譜喹諾酮類抗菌藥加雷沙星以及新型突變體B-Raf(V600E)強(qiáng)選擇性激酶抑制劑[1-2]。轉(zhuǎn)氨酶催化前手性酮的直接胺化為手性純胺的合成提供了一個較優(yōu)的選擇[3],但水溶性的酶分子在苛刻的反應(yīng)條件下穩(wěn)定性和選擇性較差,同時儲存、回收和清除細(xì)胞碎片也相當(dāng)困難[4-5]。連續(xù)流生物催化具有催化效率快、時空產(chǎn)率高,易于下游處理(便于分離)等優(yōu)點[6],已成為綠色可持續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)的重要研究領(lǐng)域。因此將酶固定在樹脂載體上用于連續(xù)流催化合成(R)-1-(4-溴苯基)乙胺具有一定的研究價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

LC-20AD型高效液相色譜儀、SPD-M20A檢測器,日本島津;CMax Plus酶標(biāo)儀,美谷分子儀器;ES-1、ES-103B、ESR-2,天津南開和成;LX-1000EP、LX-1000HA,西安藍(lán)曉;ReliZyemTMOD-403,日本三菱化工;ATA-117轉(zhuǎn)氨酶由實驗室構(gòu)建并保藏;Bradford蛋白濃度測定試劑盒,生工生物工程;其他常規(guī)試劑均為市售分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 固定化載體的篩選

配制100 mmol/L、pH 8.0的磷酸鹽緩沖液5 mL,加入0.5 g樹脂載體和20 mg轉(zhuǎn)氨酶,混合后置于30 ℃下攪拌24 h,過濾洗滌,加入50 mmol/L、pH 8.5的磷酸鹽緩沖液5 mL(含3 mol/L甘氨酸),30 ℃下攪拌20 h,抽濾洗滌,得到固定化酶[7]。

1.2.2 酶蛋白質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)氨酶固定化的影響

配制100 mmol/L,pH 8.0的磷酸鹽緩沖液,分別加入定量轉(zhuǎn)氨酶凍干粉制成4,6,8,10,12,14 g/L的均一酶液。分別取2 mL酶液加入0.2 g ES-103B樹脂,置于30 ℃下攪拌24 h。

1.2.3 緩沖液鹽濃度對轉(zhuǎn)氨酶固定化的影響

配制pH 8.0,濃度為100,200,500,800,1 000,1 500 mmol/L的磷酸鹽緩沖液。分別取2 mL緩沖液加入0.02 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉及0.2 g ES-103B環(huán)氧樹脂載體,置于30 ℃下攪拌24 h。

1.2.4 緩沖液pH對轉(zhuǎn)氨酶固定化的影響

配制濃度為500 mmol/L,pH為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的磷酸鹽緩沖液。在2 mL緩沖液中加入0.02 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉及0.2 g ES-103B環(huán)氧樹脂載體,置于30 ℃下攪拌24 h。

1.2.5 固定化時間對轉(zhuǎn)氨酶固定化的影響

配制濃度為500 mmol/L,pH為7.0的磷酸鹽緩沖液,在2 mL磷酸鹽緩沖液中加入0.02 g轉(zhuǎn)氨酶凍干粉及0.2 g ES-103B樹脂載體,置于30 ℃下攪拌,分別在0,2,4,6,8,12,18,24 h時取出,結(jié)束固定化過程。

1.2.6 最適反應(yīng)pH

稱取0.2 g固定化酶,分別加入pH為6.0,7.0,8.0,8.5,9.0,9.5,10的磷酸鹽緩沖溶液(含20 mmol/L對溴苯乙酮,1 mol/L異丙胺,體積分?jǐn)?shù)10%的DMSO)1 mL,置于45 ℃下反應(yīng)1 h。

1.2.7 最適反應(yīng)溫度

稱取0.2 g固定化酶,加入100 mmol/L,pH 9.0的磷酸鈉緩沖液(含20 mmol/L對溴苯乙酮,1 mol/L異丙胺,10% DMSO)1 mL。在溫度分別為30,40,50,60,70 ℃條件下反應(yīng)1 h。

1.2.8 儲存穩(wěn)定性

將固定化酶ATA117@ES103B與游離酶ATA-117均加入100 mmol/L,pH 8.0的磷酸鹽緩沖液中,放置于4 ℃冰箱保存,每隔2 h測定相應(yīng)酶活。

1.2.9 重復(fù)批次操作穩(wěn)定性

稱取0.2 g固定化酶(ATA117@OD403,ATA117@ES103B),加入100 mmol/L,pH 9.0的磷酸鹽緩沖液(含20 mmol/L對溴苯乙酮,1 mol/L異丙胺,10% DMSO)。置于45 ℃下反應(yīng)1 h,液相檢測產(chǎn)物濃度,再加入新的反應(yīng)液進(jìn)行重復(fù)批次實驗。

1.2.10 連續(xù)流反應(yīng)系統(tǒng)的建立

以內(nèi)徑5 mm,長度10 cm的填充柱作為反應(yīng)場所,將固定化酶ATA117@ES103B填充于柱中,放置于50 ℃恒溫箱中,通過注射泵以一定流速將反應(yīng)液泵入反應(yīng)器中,在出口處收集反應(yīng)液,檢測產(chǎn)物濃度。

1.2.11 酶活的測定方法

稱取0.2 g固定化酶,加入1 mL反應(yīng)液(100 mmol/L,pH 9.0,含20 mmol/L對溴苯乙酮,1 mol/L異丙胺,10% DMSO),置于45 ℃條件下反應(yīng)1 h。將反應(yīng)液用等量乙酸乙酯萃取后,加入10 mg K2CO3和5滴乙酸酐,400 r/min下攪拌反應(yīng)1 h,再加入10 mol/L NaOH(200 μL)溶液,離心分離后液相測定產(chǎn)物濃度。

酶活定義:在45 ℃,pH 9.0條件下,每小時催化對溴苯乙酮生成1 μmol的1-(4-溴苯基)乙胺所需的酶量,即為1個酶活力單位,用U表示。

比酶活:1 g固定化酶(轉(zhuǎn)氨酶凍干粉)所含有的酶活。

酶活回收率=(固定化酶酶活/初始酶液總酶活)×100%。

轉(zhuǎn)化率=(目的產(chǎn)物的實際生成量/目的產(chǎn)物的理論生成量)×100%。

1.2.12 蛋白吸附率的測定方法

使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行粗酶液初始蛋白濃度及固定后上清殘余蛋白濃度的測定。

蛋白吸附率=[(初始蛋白濃度-上清殘余蛋白濃度)/初始蛋白濃度]×100%。

1.2.13 色譜條件

色譜柱為CHIRAlCEl OJ柱;流動相為V(異丙醇)∶V(正己烷)=1∶9;流速為0.8 mL/min;檢測波長為210 nm;柱溫為40 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化載體篩選

由于不同類型的樹脂載體攜帶的官能團(tuán)不同,使得酶蛋白和樹脂之間的固定化方式存在差異,篩選結(jié)果如表1所示。

表1 樹脂載體篩選結(jié)果一覽表

氨基樹脂和烷基樹脂是借助分子間相互作用力將酶蛋白吸附在載體表面,酶分子很容易從載體表面脫落;而環(huán)氧樹脂表面富含環(huán)氧基團(tuán),可以在常溫下與酶蛋白氨基酸殘基形成共價鍵,使酶蛋白共價連接在載體表面,大大提高了固定化酶的穩(wěn)定性。由表1可知:環(huán)氧基樹脂ES-103B蛋白結(jié)合能力最強(qiáng),蛋白吸附率為94.50%,同時其所得固定化酶酶活回收率也最高,酶活回收率為59.84%。因此選用ES-103B環(huán)氧樹脂作為最佳固定化載體。

2.2 固定化條件的優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[8-9],對ATA-117固定于ES-103B的固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化,包括酶蛋白質(zhì)量濃度、緩沖液鹽濃度、pH以及固定化時間,結(jié)果如圖1所示。

圖1 固定化條件的優(yōu)化

固定化酶的比活隨著酶質(zhì)量濃度的增加而增加,在10 g/L時達(dá)到峰值,且蛋白吸附率基本保持不變,保持在90.13%～94.88%,蛋白幾乎被完全吸附;而當(dāng)酶液增加至12 g/L時,比活出現(xiàn)微微下降的趨勢,同時蛋白吸附率也在減小。緩沖液鹽離子濃度和pH對固定化的影響中,固定化酶活回收率及比酶活都呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢,在磷酸鹽濃度500 mmol/L,pH 7.0時達(dá)到最大值。隨著固定化反應(yīng)時間的延長,固定化酶的酶活與蛋白吸附率呈現(xiàn)增長的趨勢,在8 h時固定化酶達(dá)到最高酶活,此時蛋白吸附率為95.83%。故確定較優(yōu)的酶固定化條件:m(載體)∶m(轉(zhuǎn)氨酶)=10∶1,固定化時間8 h,緩沖液濃度500 mmol/L,pH 7.0,溫度30 ℃。

2.3 固定化酶最適反應(yīng)條件

對固定化酶ATA117@ES103B的最適反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,也考察了其儲存穩(wěn)定性和重復(fù)批次操作穩(wěn)定性,結(jié)果如圖2所示。由圖2(a)可知:游離酶ATA-117的最適pH為10,而固定化酶ATA117@ES103B的最適pH為9.5,即略向酸性偏移,這可能是因為酶蛋白經(jīng)固定化后其所處微環(huán)境的電荷性質(zhì)發(fā)生了改變而造成的影響。由圖2(b)可知:在對ATA117@ES103B與游離酶ATA-117的穩(wěn)定性比較實驗中,發(fā)現(xiàn)游離酶隨著存儲時間的增加,酶活持續(xù)大幅度降低,在第10天時殘余酶活為初始值的53.21%,在第15天時僅有27.43%的酶活殘留;而ATA117@ES103B在前10 d左右酶活沒有明顯的損失,在存儲15 d后,殘余酶活為初始值的89.83%,展現(xiàn)了出色的存儲穩(wěn)定性。由圖2(c)可知:溫度對固定化酶活影響較大,故確定最適反應(yīng)條件為:pH 9.5,溫度50 ℃。由圖2(d)可知:在ATA117固定于烷基樹脂載體OD403和環(huán)氧基樹脂載體ES103B的重復(fù)操作穩(wěn)定性比較實驗中,固定化酶ATA117@OD403在使用至第4次時,還保留了初始值的72.36%的活性,隨后大幅度減小,當(dāng)重復(fù)使用至10次時,殘余酶活僅為7.62%;而ATA117@ES103B在重復(fù)使用至第4次時,保留有94.83%的殘余酶活,當(dāng)重復(fù)操作10次后,殘余酶活為80.41%,具有良好的重復(fù)批次使用穩(wěn)定性。

圖2 固定化酶的最適反應(yīng)條件

2.4 連續(xù)流反應(yīng)條件的優(yōu)化

對所建連續(xù)流反應(yīng)器系統(tǒng)的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,包括流向、流速以及填料量,結(jié)果如圖3所示。由圖3(a)可知:在保持其他條件相同的情況下,分別將反應(yīng)液從上至下(下流系統(tǒng))和從下至上(上流系統(tǒng))泵入反應(yīng)器,發(fā)現(xiàn)無論是在慢速(0.2 mL/min)、中速(0.5 mL/min)還是快速(1.0 mL/min)的流速條件下,下流系統(tǒng)中洗脫液的轉(zhuǎn)化率均略高于上流系統(tǒng)。由圖3(b)可知:反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨著反應(yīng)器中ATA117@ES103B用量的增加而升高,考慮到使反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的最大化,故采用2.0 g的固定化酶使用量為最佳填料量。由圖3(c)可知:降低流速能夠增加底物與固定化酶的接觸時間,使其充分反應(yīng)從而提高轉(zhuǎn)化率,然而流速為0.2～0.3 mL/min時,轉(zhuǎn)化率并沒有明顯變化,因此確定流速為0.3 mL/min,反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為93.43%。

圖3 連續(xù)流條件的優(yōu)化

2.5 最優(yōu)條件下連續(xù)流反應(yīng)器的催化效力及其可持續(xù)性能

根據(jù)上述實驗結(jié)果,將連續(xù)流生物催化反應(yīng)的工藝條件調(diào)整為:固定化酶填料量為2.0 g,以0.3 mL/min的流速將反應(yīng)液從上至下泵入反應(yīng)柱中,柱溫箱50 ℃。計算得反應(yīng)器中具有催化能力的有效體積(即固定化酶總體積)約為1.96 mL,則反應(yīng)液在反應(yīng)器中的停留時間(即反應(yīng)液在反應(yīng)器中與固定化酶接觸并發(fā)生反應(yīng)的時間)約為6.54 min。分別在連續(xù)流催化模式與間歇反應(yīng)模式下進(jìn)行(R)-1-(4-溴苯基)乙胺的不對稱合成,將反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行對比,如表2所示。在連續(xù)流操作的最佳條件下,20 mmol/L的對溴苯乙酮在不到7 min的停留時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率即可達(dá)到93%,催化效率為2.804 μmol/(min·g),比相應(yīng)的間歇反應(yīng)高出7倍,計算時空產(chǎn)率為789.85 g/(L·d)。

表2 間歇反應(yīng)與連續(xù)流反應(yīng)合成(R)-1-(4-溴苯基)乙胺

3 結(jié) 論

對6種不同類型的樹脂載體進(jìn)行篩選,確定ES-103B環(huán)氧樹脂作為最佳固定化酶載體。通過單因素優(yōu)化確定了較優(yōu)的ATA-117轉(zhuǎn)氨酶固定化條件、所得固定化酶ATA117@ES103B的最適反應(yīng)溫度和pH。構(gòu)建連續(xù)流反應(yīng)系統(tǒng),對連續(xù)流反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳反應(yīng)條件是:固定化酶填料量2.0 g,流速0.3 mL/min,反應(yīng)液從上至下泵入反應(yīng)器。該研究使得在連續(xù)流反應(yīng)系統(tǒng)中不對稱合成(R)-1-(4-溴苯基)乙胺成為可能,理論上該系統(tǒng)可應(yīng)用于其他更多重要藥物中間體的合成,具有一定的應(yīng)用價值。