陳利華,陳小草,林鴻瀚,陳 紅,丁玉庭,3,4,周緒霞,3,4

(1.紹興市白馬湖食品有限公司,浙江 紹興 312367;2.浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州 310014;3.浙江省深藍(lán)漁業(yè)資源高效開發(fā)利用重點實驗室,浙江 杭州 310014;4.國家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(杭州),浙江 杭州 310014)

魚糜是一種具有優(yōu)良彈性的凝膠體,其凝膠品質(zhì)受許多因素的影響,其中,外源油脂的添加會極大地影響魚糜的流變性和微觀結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響魚糜的品質(zhì)特性[1-4]。與直接添加油脂相比,預(yù)乳化處理更有利于油脂在凝膠中的均勻分布[5],而乳化液的物理化學(xué)性質(zhì)及其界面結(jié)構(gòu),包括乳化后的尺寸大小和油滴的存在環(huán)境等,會影響油脂-油脂及油脂-蛋白之間的界面性質(zhì),并進(jìn)一步影響乳化液及其在凝膠中的穩(wěn)定性[2]。蛋白質(zhì)是一種天然的食品乳化劑,可吸附在油水界面,降低界面張力,并通過疏水相互作用力和靜電相互作用起到穩(wěn)定乳液體系的作用[6-8]。但蛋白質(zhì)乳化性受蛋白質(zhì)表面疏水性、蛋白質(zhì)粒徑、活性巰基含量等多種因素的影響[9-10]。在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳化液體系中,乳化液的穩(wěn)定性主要取決于蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)以及油-水界面處蛋白吸附成膜的黏彈性,通過增加界面中吸附蛋白量可以有效改善乳化液穩(wěn)定性[11-12]。肌原纖維蛋白是魚肉的主要成分,由肌球蛋白、肌動蛋白和肌動球蛋白等鹽溶性蛋白組成,在凝膠化和乳化中起重要作用[13-15]。同時,肌原纖維蛋白也是一種優(yōu)良的蛋白質(zhì)乳化劑。Shi等[16]研究表明:將肌原纖維蛋白、油和水混合后進(jìn)行高壓均質(zhì)化處理時,肌原纖維蛋白會吸附至油滴界面形成界面蛋白膜,使其張力降低,促進(jìn)油滴在水相中的分散,同時油滴界面上的蛋白質(zhì)保護(hù)層可以在一定程度上抑制油滴的凝結(jié)。乳液特性受體系成分、蛋白質(zhì)和油脂濃度、制備方法等多方面影響[17]。Chung等[18]研究證明了油滴濃度對液態(tài)奶精的外觀、黏度和穩(wěn)定性有重要作用;Saeidy等[19]的研究也表明油體積分?jǐn)?shù)的增大增強(qiáng)了乳液的穩(wěn)定性。

本課題組前期研究表明油茶籽油乳化液對魚糜制品特性有影響,但研究中也發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白作為蛋白質(zhì)表面活性劑,其濃度及其與油茶籽油的配比會直接影響乳化液的穩(wěn)定性及其在魚糜體系中的穩(wěn)定性[2]。因此,筆者以油茶籽油為研究對象,以肌原纖維蛋白為蛋白乳化劑對油茶籽油進(jìn)行預(yù)乳化,分析肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度和油茶籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳化液乳化穩(wěn)定性、界面流變性、表面巰基和總巰基含量等的影響,為高品質(zhì)魚糜制品的制備提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

新鮮鰱魚購于當(dāng)?shù)厥袌?油茶籽油(不含膽固醇和黃菌霉素,杭州久晟生物科技有限公司)購于當(dāng)?shù)爻?十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉和Tris均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultra-Turrax乳化均質(zhì)機(jī),德國IKA;CR21GⅡ高速冷凍離心機(jī),日本日立公司;MCR52高級拓展流變儀,奧地利安東帕有限公司;UV759紫外分光光度儀,上海奧普勒儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白制備

參照Sun等[20]的方法并適當(dāng)修改,制備鰱魚肌原纖維蛋白。魚去皮和內(nèi)臟后清水洗凈,取魚肉剪碎放入燒杯中,加入4倍體積的冰磷酸鹽緩沖溶液(0.025 mol/L Na2HPO4和0.025 mol/L NaH2PO4混合液,pH 6.8),倒入攪拌機(jī)中勻漿,然后4 ℃,12 000 r/min離心15 min,去除上清液,取沉淀。沉淀物中加入4倍體積的冰磷酸鹽緩沖液勻漿,勻漿液用2層紗布過濾,保留濾液,濾液離心后去除上清液,沉淀用4倍體積的0.1 mol/L冰NaCl溶液沖洗,離心所得沉淀物即為魚糜肌原纖維蛋白。通過雙縮脲法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,置于4 ℃冰箱備用,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度以冰磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L Na2HPO4和0.05 mol/L NaH2PO4混合液,pH 6.8)調(diào)節(jié)。

1.3.2 乳化液的制備

以1.3.1制備的肌原纖維蛋白為乳化劑對油茶籽油進(jìn)行乳化,研究不同肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度和油茶籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳液的影響。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果,將乳化液分2組:1)控制乳液中油茶籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%,NaCl濃度0.6 mol/L,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別設(shè)定為30,60,90,120 mg/mL,混合后分別于10 000 r/min乳化均質(zhì)1 min;2)控制乳液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為90 mg/mL,NaCl濃度為0.6 mol/L,油茶籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)定為5%,10%,20%和30%,混合后分別于10 000 r/min乳化均質(zhì)1 min。得到乳化液后立即進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3.3 乳化活性和乳化穩(wěn)定性測定

20 μL乳化液中加入5 mL 0.1% SDS溶液后混合均勻,在500 nm處測定吸光值,記為A0。乳化液靜置10 min后采用相同的方法測定乳化液吸光值,記為A10,以0.1% SDS溶液作空白對照。乳化活性指數(shù)(Emulsifying activity index,EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(Emulsifying stability index,ESI)計算公式[21]為

(1)

(2)

式中:T=2.303;N為稀釋倍數(shù);C為乳狀液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,g/mL;φ為乳狀液油相的體積分?jǐn)?shù)。

1.3.4 表面巰基和總巰基摩爾質(zhì)量比率的測定

參考Plancken等[22]的方法并略作修改。

1)表面巰基摩爾質(zhì)量比率的測定:取1 mL樣品溶液,加入4 mL Tris-甘氨酸緩沖液(0.01 mol/L EDTA,pH 8.0)和125 μL DTNB(20 mg DTNB溶于5 mL 0.1 mol/L的Tris-甘氨酸緩沖液,pH 8.0),混合均勻后在25 ℃下靜置15 min,測定在412 nm處的吸光值。

2)總巰基摩爾質(zhì)量比率的測定:取1 mL樣品溶液,加入4 mL Tris-甘氨酸緩沖液(0.01 mol/L EDTA,0.25% SDS,pH 8.0),混合均勻后按照表面巰基摩爾質(zhì)量比率的測定方法測定。巰基的摩爾質(zhì)量比率SH的計算公式為

(3)

式中:A412為樣品溶液在412 nm處的吸光值;C為樣品質(zhì)量濃度,mg/mL;D為樣品稀釋倍數(shù),取5.125。

1.3.5 界面剪切流變性質(zhì)測定

界面剪切流變性分別通過穩(wěn)態(tài)和動態(tài)2種模式掃描,測定溫度25 ℃。穩(wěn)態(tài)剪切掃描測定不同剪切速率下乳化液的剪切黏度,剪切速率為0.01～1 000 s-1。動態(tài)振蕩模式實驗先進(jìn)行0.01%～100%范圍的應(yīng)變掃描,固定頻率為1 Hz,之后根據(jù)掃描結(jié)果確定線性黏彈區(qū)并選擇合適的應(yīng)變值進(jìn)行動態(tài)頻率掃描,頻率掃描范圍為0.1～10 Hz,測量儲能模量G′在0.1%應(yīng)變下的頻率的函數(shù)曲線。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,SPSS 19.0進(jìn)行方差分析,Duncan法進(jìn)行多重比較(P<0.05表示差異顯著),Origin 8.6繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度對乳化液特性的影響

2.1.1 肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度對乳化液EAI和ESI的影響

乳化特性是蛋白質(zhì)主要的功能特性之一,EAI和ESI是衡量蛋白質(zhì)乳化特性的重要指標(biāo)。肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度對乳化液乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響見圖1。

圖1 肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度對乳化液乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

由圖1可知:隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度升高,乳液的EAI顯著降低,ESI呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(P<0.05)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度從30 mg/mL增加到120 mg/mL時,EAI從0.40 m2/g降到0.19 m2/g,與Agyare等[23]對胰凝乳蛋白酶水解小麥面筋的研究結(jié)果一致。一般認(rèn)為:EAI對蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的依賴性可用吸附動力學(xué)解釋,在低蛋白質(zhì)量濃度下,蛋白質(zhì)的快速吸附使油-水界面處蛋白質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)增大,油相和水相之間的相互作用增強(qiáng),而在高蛋白質(zhì)量濃度下,蛋白質(zhì)因活化能障礙無法以擴(kuò)散依賴性方式遷移而降低了乳化活性[24]。同EAI變化趨勢不同,隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度從30 mg/mL增加到120 mg/mL時,ESI從15.70 min增加到60.09 min,最后降到52.72 min,呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(P<0.05)。ESI升高可能與油脂和蛋白質(zhì)之間界面膜厚度的增加有關(guān)。但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度在120 mg/mL時,蛋白質(zhì)在吸附過程中形成多層吸附結(jié)構(gòu),過多的蛋白質(zhì)會以松散方式參與到多層吸附結(jié)構(gòu)的形成中,導(dǎo)致蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性的降低[25]。研究也表明分子吸附過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開會增強(qiáng)分子間相互作用而導(dǎo)致蛋白分子之間交聯(lián)絮凝[26]。

2.1.2 肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度對乳化液中游離巰基和總巰基的影響

巰基對蛋白質(zhì)功能特性有很大影響,肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度對乳化液游離巰基和總巰基摩爾質(zhì)量比率的影響見圖2。隨著乳液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的升高,游離巰基和總巰基摩爾質(zhì)量比率均顯著降低(P<0.05)。其中總巰基由8.89 μmol/g降到4.30 μmol/g;游離巰基由4.55 μmol/g降到1.82 μmol/g,但游離巰基摩爾質(zhì)量比率在蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為60 mg/mL和90 mg/mL時無差異(P>0.05)。一般認(rèn)為是巰基的氧化和二硫鍵的生成導(dǎo)致了游離巰基和總巰基的減少[27]。二硫鍵是維持天然蛋白質(zhì)致密結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)鍵,其適量形成可以在一定程度上提高乳化液的穩(wěn)定性。因此,在一定的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的升高,乳化液游離巰基摩爾質(zhì)量比率降低,乳化液穩(wěn)定性增加,與ESI的研究結(jié)果一致[16]。

圖2 肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度對乳化液游離巰基和總巰基的影響

2.1.3 肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度對乳化液界面流變性的影響

乳化液的黏度隨剪切速率的變化曲線見圖3。由圖3可知:肌原纖維蛋白乳化液存在“剪切稀化”行為[28],隨著剪切速率的增加,分子間相互作用減弱,流動阻力減小,乳液黏度下降并最終趨于穩(wěn)定,導(dǎo)致乳液在一定剪切速率下流動更加有序。相同剪切速率下,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度越高,蛋白質(zhì)間作用力越強(qiáng),乳液黏度越大,乳液也更加穩(wěn)定[29]。

圖3 乳化液的黏度隨剪切速率的變化曲線

隨著剪切速率的增加,不同質(zhì)量濃度的肌原纖維蛋白乳化液的儲能模量G′隨頻率的加大逐漸增加,肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度對乳化液G′的影響見圖4。當(dāng)乳化液中肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度為120 mg/mL時,G′最大。G′升高的原因可能是由于蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)包裹油滴之間的疏水相互作用和二硫鍵的交聯(lián)作用的增強(qiáng)[8]。當(dāng)乳化劑(即蛋白質(zhì))質(zhì)量濃度較高時,乳化劑快速吸附到界面上,繼而展開重排,完全覆蓋在油滴表面,緊密排列的界面膜的黏彈性、厚度增加,乳化液趨于形成弱凝膠結(jié)構(gòu)[30-31]。

圖4 肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度對乳化液G′的影響

綜合各項指標(biāo),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度為90 mg/mL時肌原纖維蛋白乳化液具有較強(qiáng)的剪切稀化能力,在剪切過程中流體組織較有序,且界面膜的黏彈性和穩(wěn)定性較高[32],因此在接下來的實驗中設(shè)定肌原纖維蛋白質(zhì)量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90 mg/mL,進(jìn)一步研究油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳液穩(wěn)定性的影響。

2.2 油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳化液特性的影響

2.2.1 油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳化液EAI和ESI的影響

油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳化液乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響見圖5。由圖5可知:當(dāng)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)從5%增加到30%時,EAI從0.40 m2/g降到0.17 m2/g,呈顯著降低趨勢(P<0.05)。在一定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度下,乳化液在高油相體積分?jǐn)?shù)時形成的油相表面積較小。添加油脂為蛋白質(zhì)提供一個疏水環(huán)境,隨著油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大,蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)被埋藏,致使其表面疏水性降低,進(jìn)而降低乳化液的乳化活性。乳化液乳化穩(wěn)定性隨油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢(P<0.05),當(dāng)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時,乳化液穩(wěn)定性最高。較高的油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)可增加乳化液的黏度,進(jìn)而提高其乳化穩(wěn)定性,但當(dāng)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)已達(dá)到飽和后繼續(xù)增大其質(zhì)量分?jǐn)?shù),會導(dǎo)致乳化剪切過程中蛋白質(zhì)無法包裹住過多的油脂,蛋白界面膜被打破,引起油脂顆粒碰撞聚集增大,從而降低乳化液的穩(wěn)定性。

圖5 油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳化液乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

2.2.2 油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳化液游離巰基和總巰基的影響

油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳化液游離巰基和總巰基的影響見圖6,游離巰基和總巰基的摩爾質(zhì)量比率均隨油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加呈先降低后增加趨勢,當(dāng)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%和20%時,游離巰基和總巰基的摩爾質(zhì)量比率最低。油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大時,乳化液中油脂與水相中助氧化劑的接觸面積增大,同時表面界面膜的產(chǎn)生會使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化,多肽鏈展開,增加巰基暴露程度,使更多巰基氧化為二硫鍵[17]。筆者推測:當(dāng)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時,蛋白質(zhì)分子內(nèi)部或分子間的一部分巰基發(fā)生的氧化反應(yīng)或巰基/二硫鍵的交換反應(yīng)最強(qiáng),體系中二硫鍵濃度最高,乳化液乳化穩(wěn)定性也相對最高。

圖6 油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳化液游離巰基和總巰基的影響

2.2.3 油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳化液界面流變性的影響

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)油脂乳化液的黏度隨剪切速率的變化見圖7。由圖7可知:相同剪切速率下,油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大,乳液黏度越大。在較大油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)(20%和30%)下,油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高,乳化液的黏度隨剪切速率(0～600 s-1)的增加下降得越快。5%和10%油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的乳化液曲線十分接近,且黏度變化不大,表明油脂對乳液黏度的影響與蛋白質(zhì)相似,存在“剪切稀化”行為[28]。

圖7 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)油脂乳化液的黏度隨剪切速率的變化曲線

油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳化液G′的影響見圖8。由圖8可知:乳化液的G′隨著油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而增加。粒徑大小、界面膜強(qiáng)度、分散相和連續(xù)相的黏度以及密度差等均會影響乳化液的穩(wěn)定性,但蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)以及油-水界面處蛋白吸附成膜的黏彈性是其中的主要影響因素[33-36]。添加具有黏彈性的油脂,可以增加乳化液中分散相的黏度。筆者實驗中,隨著油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高,蛋白質(zhì)與油脂兩者間逐漸達(dá)到飽和,形成的界面膜不斷增厚,有利于穩(wěn)定油滴顆粒。但當(dāng)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時,蛋白質(zhì)界面膜無法包裹住油滴,油滴之間易凝結(jié)從而不利于乳化液的穩(wěn)定。綜合分析,當(dāng)油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時得到的乳化液黏度較高,儲能模量也越高,得到的乳化液更穩(wěn)定。

圖8 油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳化液G′的影響

3 結(jié) 論

重點分析了蛋白質(zhì)乳化劑的質(zhì)量濃度和油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)對油茶籽油乳化液穩(wěn)定性的影響。研究結(jié)果表明:一定范圍內(nèi),蛋白質(zhì)乳化劑質(zhì)量濃度的增加可以在一定程度上增加蛋白質(zhì)-油脂界面膜的厚度,提高界面膜和蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性,但過高的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度會引起蛋白質(zhì)在水相中的積累而降低乳化液的穩(wěn)定性。增大油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)會提高乳化液的黏度,進(jìn)而提高乳化液的乳化穩(wěn)定性,但是在油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到20%后,繼續(xù)添加油脂,會因在乳化剪切過程中蛋白質(zhì)無法包裹住所有的油脂而使蛋白界面膜被打破,導(dǎo)致油脂顆粒因碰撞聚集而體積增大,降低乳化液的穩(wěn)定性;在肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度90 mg/mL、油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時,可以得到穩(wěn)定性較好的乳化液,研究結(jié)果可以為通過在魚糜中添加油脂改善其營養(yǎng)和品質(zhì)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。